Confident Characterization of N- and O-Linked Glycopeptides Using Electron-Based Dissociation on a timsOmni Platform

Význam tématu

Glykopeptidová analýza je kritická pro pochopení biologické funkce glykosylací v proteinech a pro aplikace v biomedicíně, kvalitě terapeutik a výzkumu glykoform. Efektivní charakterizace vyžaduje fragmentační metody, které současně zachovají informace o navázaném glykanu (pro lokalizaci míst glykosylace, zvláště u O-glykosylací) a zároveň generují bohaté fragmenty sacharidové části (pro strukturální determinaci N-glykanů). Implementace řízené elektronové disociace (tExD) na platformě timsOmni nabízí flexibilní, naladitelné elektronové fragmentační režimy, které mohou tyto požadavky naplnit a zároveň podporují vysokopropustné analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyhodnotit různé režimy tExD (vč. ECD, hECD, EID, ECciD, EIciD a hybridní EXciD/ECciD) na timsOmni platformě pro spolehlivou charakterizaci N- a O-glykopeptidů. Studie porovnává schopnost lokalizovat glykační místa, zachovat glykan na fragmentech páteře peptidu a poskytnout bohatou glykanovou fragmentaci pro strukturální analýzu. Hodnocení zahrnovalo syntetické standardy i proteolytické digesty, různé náboje prekurzorů a cílené DDA-PASEF režimy s inclusion listy.

Použitá metodika a instrumentace

Analytika a postupy použité ve studii:

• Separace: nanoElute LC.
• Ion-mobility a akumulace: TIMS (timsOmni platforma).
• Fragmentace: Omnitrap s volitelnými elektrony řízenými režimy tExD — ECD, hECD, EID, ECciD, EIciD a hybridní EXciD/ECciD; režimy umožňují nastavení energie (uváděné orientačně: EXciD ~2 eV, ECciD ~7 eV, hECD ~15 eV, ECID ~35 eV) a doplňkovou asistenci kolizí podle nábojového stavu přenašeče.
• Režim akvizice: DDA-PASEF s cílenými inclusion listy a vyhodnocováním různých nábojových stavů prekurzorů.
• Zpracování dat: FragPipe (MSFragger-Glyco, MS-Shepherd, O-Pair) s doplňkovou validací v Byonic; manuální anotace spekter v OmniScape, Glypy a GlycoWorkbench.

Použitá instrumentace

• Bruker timsOmni platforma s Omnitrap pro tExD fragmentaci.
• nanoElute LC systém pro nano-kapilární chromatografii.
• TIMS pro ion-mobility separaci a akumulaci iontů.
• Softwarové nástroje: FragPipe (MSFragger-Glyco, MS-Shepherd, O-Pair), Byonic, OmniScape, Glypy, GlycoWorkbench.

Hlavní výsledky a diskuse

• tExD umožňuje zachování navázaných glykanů současně s rozsáhlou fragmentací páteře peptidu, což zlepšuje lokalizaci O-glykozylace díky glykan-retaining c a z• fragmentům. Naopak tradiční CID často vede k uvolnění glykanu a ztrátě lokalizační informace.
• ECciD a EIciD vykázaly srovnatelný počet glycoPSM, počtů glykopeptidových prekurzorů a unikátních identifikací v cílených DDA-PASEF experimentech s inclusion listem. Nicméně ECciD generuje více vysokohmotnostních Y-iontů užitečných pro strukturální determinaci glykanů a poskytuje lepší pokrytí páteře peptidu.
• Fragmentační chování je výrazně závislé na nábojovém stavu prekurzoru; efektivita radikálových fragmentací vyžaduje optimalizaci asistovaných kolizních energií pro jednotlivé nábojové stavy.
• Příklady spektrometrie ukázaly rozsáhlé sekvenční pokrytí a přítomnost glykan-retaining fragmentů u N-glycopeptidů při použití ECciD, což umožňuje současnou lokalizaci a strukturální analýzu.

Přínosy a praktické využití metody

• Flexibilní tEdX/TIMS architektura na timsOmni umožňuje uživatelské naladění fragmentačního režimu podle třídy glykopeptidu (N vs O) a nábojového stavu, čímž zvyšuje spolehlivost lokalizace a struktury glykanů ve stejném experimentu.
• Hybridní ECciD/EXciD režimy nabízejí kompromis mezi zachováním glykanu a generováním diagnostických glykanových iontů, užitečné pro reportovací workflow v glykoproteomice a QC bioterapeutik.
• Podpora DDA-PASEF a inclusion listů umožňuje cílené, vysoce propustné analýzy pro komplexní vzorky bez potřeby obětovat kvalitu fragmentačních spekter.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace tExD s 4D-multiomics pracovními postupy (kombinace LC, TIMS, MS/MS a časové dimenze) pro komplexní profilaci glykosylací v biologických systémech.
• Automatizace optimalizace parametrů na základě nábojového stavu a typu glykopeptidu, případně pomocí strojového učení pro urychlení metodiky a zvýšení reprodukovatelnosti.
• Dalsí zdokonalení softwaru pro de novo interpretaci radikálových spekter a lepší integraci glyko-specifických modulů do existujících balíků (např. hlubší integrace výstupů MSFragger-Glyco, O-Pair, Byonic a manuálních nástrojů).
• Rozšíření aplikací do klinických a průmyslových provozů po validaci a standardizaci, zejména pro analýzu glykanských heterogenit u bioterapeutik a biomarkerů.

Závěr

Implementace řízených elektronových fragmentačních režimů tExD na timsOmni platformě umožňuje flexibilní, nábojově závislou optimalizaci fragmentation pro N- i O-glykopeptidy. ECciD vyniká zachováním glykanů při současném generování bohatých peptidových fragmentů a vyššího počtu vysokohmotnostních Y-iontů, což podporuje důkladnou strukturální elucidaci. Celkově poskytují tExD workflowy vysokou kvalitu dat pro lokalizaci glykosylací a strukturální analýzu, přičemž ECciD a EIciD nabízejí srovnatelné identifikační výkony s výhodou ECciD pro detailní strukturální informace.

Reference

1. Bai H., Barla I., Grigoriadis A., Marx K., Armony G., Busch F., Smyrnakis A., Chopiuk G., Tremintin G., Papanastasiou D., Willetts M. Confident Characterization of N- and O-Linked Glycopeptides Using Electron-Based Dissociation on a timsOmni Platform. Bruker white paper WP396, 2026.