Advanced Native and Top-Down MSⁿ Workflows on the timsOmni Platform Enable Deep Structural Analysis of Membrane Protein Complexes

Advanced Native and Top-Down MSn Workflows on the timsOmni Platform — shrnutí

Význam tématu

Membránové proteiny tvoří klíčovou třídu farmaceutických cílů a hrají zásadní roli v buněčných procesech. Jejich analýza je však komplikovaná heterogenitou oligomerických stavů, proteoformami a četnými posttranslačními modifikacemi (PTM), zejména lipidací. Schopnost lokalizovat a detailně strukturálně popsat tyto modifikace v rámci nativních multimerických komplexů zásadně zlepšuje pochopení funkce a interakcí a má přímý dopad na výzkum cílené farmacie a strukturální proteomiku.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce bylo ukázat pokročilé nativní top-down MSn workflows na platformě timsOmni pro hlubokou strukturální analýzu membránových proteinových komplexů. Autoři demonstrovali metodiku na heteropentamerickém komplexu BamABCDE, zaměřili se na systematickou disociaci komplexu a na detailní lokalizaci N-terminální lipidace jednotlivých lipoproteinových podjednotek pomocí vícestupňové MS analýzy (isCID, MS3, MS4 RCID) společně se strategií obohacování iontů nízké intenzity.

Použitá metodika a instrumentace

• Platforma: timsOmni (Bruker) kombinující ion mobility s OmnitrapTM a kvadrupólovou selekcí.
• Ionizace: nativní nanoESI s otevřenými potaženými emitery (bias ≈ 1,3 kV), 1 mm i.d. skleněný inlet při ~8 mbar.
• Desolvace / in-source CID (isCID): urychlení iontů 120–200 eV při ~0,5 mbar pro disociaci intact komplexu na podjednotky.
• Hmotnostní selekce: kvadrupól pro rozsahy m/z < 4500 Th; Q2 segment OmnitrapTM pro izolaci a akumulaci větších iontů.
• Fragmentace: psMS2 CID (isCID) pro rozložení komplexu, následně MS3 a MS4 RCID (resonance CID) v Q2 pro generování a detailní štěpení b-/y-typ fragmentů.
• Iontové obohacování: opakované akumulační cykly pro zvýšení signálu nízkoabundantních lipidovaných fragmentů před dalším štěpením.
• Analýza dat: OmniScapeTM pro zpracování MSn dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Systematická disociace BamABCDE: isCID umožnila rozložení intact komplexu na jednotlivé podjednotky, které byly následně cíleně analyzovány na úrovních MS3 a MS4.
• Detekce a lokalizace N-terminální lipidace: pomocí selektivního obohacení nízkoabundantních b-typ fragmentů vzniklých v MS3 a následného MS4 RCID byla plně charakterizována lipidová kotva u podjednotky BamE a potvrzena i u BamD.
• Strukturní identifikace lipidového kotvení: MS4 RCID prokázala přítomnost neutrálních ztrát odpovídajících palmitové (C16:0) a olejové (C18:1) kyselině, fragmentům glycerolového páteře (1-oleoyl-2-palmitoyl-glycerol) a ztrátě S-vázaného diacylglycerolu, což indikuje vazbu glycerolu na cysteinu N-terminu. Dále byla pozorována ztráta hexadecylové skupiny, potvrzující přítomnost druhé palmitoylové jednotky v S-vazbě.
• Konvergentní nálezy mezi podjednotkami: MS3 spektra pro BamD vykazovala obdobné lipidové posuny a charakteristické ztráty (CH2, C2H4), což umožnilo lokalizaci lipidace též na N-terminální cystein.
• Význam iontového obohacování: selektivní izolace a opakovaná akumulace nízkointenzitních lipidovaných fragmentů významně zvýšila S/N a učinila možné provedení dalšího stupně fragmentace (MS4), který byl klíčový pro strukturální dedukce.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní lokalizace PTM v nativních komplexech: workflow umožňuje při zachování nativního stavu komplexu přesnou lokalizaci lipidací a dalších modifikací přímo z peptidových fragmentů získaných z intact proteinu.
• Zvýšená citlivost pro nízkoabundantní modifikace: strategie iontového obohacení a akumulace činí přístupnou analýzu modifikovaných fragmentů, které by jinak zůstaly skryté v rušném spektru.
• Široké uplatnění: metoda nachází využití ve strukturální proteomice, studiích proteoform, při charakterizaci lipoproteinů a při farmaceutickém výzkumu zaměřeném na membránové bílkoviny.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a vyšší propustnost: integrace akumulačních a obohacovacích kroků do automatizovaných workflow pro rutinní analýzu většího počtu vzorků.
• Propojení s ion mobility daty: využití ion-mobility pro další rozlišení proteoform a konformačních izomerů v kombinaci s MSn pro bohatší strukturální informace.
• Pokročilá bioinformatika a AI: nasazení pokročilých algoritmů pro identifikaci PTM a de novo interpretaci složitých MSn spekter.
• Rozšíření na jiné typy PTM a komplexů: adaptace metody pro glykozylace, kovové ko-faktory a dynamické interakce s lipidovými nanodiskami či chaperony.

Závěr

Studie demonstrovala, že kombinace nativního top-down přístupu, selektivní fragmentace (RCID) a iontového obohacení na platformě timsOmni umožňuje detailní lokalizaci a strukturální vyčíslení N-terminální lipidace v rámci intact membránového komplexu BamABCDE. Metodika poskytuje robustní cestu k charakterizaci složitých modifikací v multimerických proteinech a rozšiřuje možnosti strukturální proteomiky zaměřené na membránové targety.

Reference

• Norris J., Oluwole A.O., Kosmopoulou M., Baluya D., Barla I., Smyrnakis A., Papanastasiou D., Struwe W., Robinson C.V. Advanced Native and Top-Down MSn Workflows on the timsOmni Platform Enable Deep Structural Analysis of Membrane Protein Complexes. Bruker, 2026. (Prezentace / výsledky společnosti Bruker)

Použité instrumenty a zdroje dat

• timsOmni platforma (Bruker) s OmnitrapTM a kvadrupólem pro selekci; TOF analyzátor pro detekci.
• NanoESI zdroj s otevřenými potaženými emitery; parametry isCID 120–200 eV, tlak desolvace ~0,5 mbar.
• Software OmniScapeTM pro zpracování MSn dat.