Offline tandem MSn workflows on the timsOmni platform for deep sequencing of intact proteins and mAbs

Význam tématu

Top-down hmotnostní spektrometrie (TDMS) poskytuje přímou analýzu celých proteinů a monoklonálních protilátek (mAbs) bez nutnosti enzymatické štěpné hydrolýzy. Díky této metodě lze získat komplexní pohled na proteoformy, průběh disulfidových vazeb a post-translační modifikace. Hlavní překážky širšího použití zahrnují rozložení signálu do mnoha nábojových stavů, nízký poměr signálu k šumu a omezené pokrytí sekvence.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo implementovat offline vícestupňové (MSn) workflow na platformě timsOmni pro detailní „deep sequencing“ nedenaturovaných intactních proteinů a mAbs. Autoři představují kombinaci in-source CID (isCID), elektronové perkusační metody (ECD/EID) a kolizně aktivovaného rozkladu po redukce náboje (RCID), aby maximalizovali sekvenční pokrytí a mapovali disulfidické vazby.

Použitá metodika

Vzorek: NISTmAb v 3,3 μM roztoku H2O/ACN (50:50) s 0,1 % kyselinou mravenčí.
Ionizace: nanoESI zdroj NEOS (Bruker).
MSn workflow:

• isCID (in-source CID) pro uvolnění podjednotek a N-terminálních fragmentů.
• ps.MS2 isCID pro generování b-typových fragmentů.
• ps.MS3 ECD/EID (50 ms) pro tvorbu c- a a-iontů a částečnou redukci intrachain disulfidů.
• ps.MS4 RCID pro kolizní štěpení nábojem redukovaných iontů (ECnoD) a finální mapování svorek.

Použitá instrumentace

• timsOmni platforma s vysokorychlostním ortogonálním akceleračním TOF analyzátorem (OA-TOF).
• Kvadrupólový hmotnostní filtr a Omnitrap pro akumulaci a řízenou aktivaci iontů.
• NanoESI zdroj NEOS a pokovené otevřené kapiláry (Humanix Cellomics).
• Software OmniScape pro interpretaci MSn dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementované isCID-MSn postupy vedly k výraznému nárůstu sekvenčního pokrytí intactních LC a HC subjednotek:

• ps.MS2 isCID: ~45 % pokrytí LC, ~41 % pokrytí HC.
• ps.MS3 ECD/EID: úplné sekvenční informace v oblasti CDR3 a částečná redukce prvních disulfidů.
• ps.MS4 RCID: až 83 % pokrytí oblastí vázajících svorky, 88 % kombinované b-ionty.

Workflow ukázal synergii mezi různými aktivacemi a schopnost přesně mapovat disulfidické vazby.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené offline MSn postupy umožňují:

• Hluboké sekvenční pokrytí intactních mAbs bez chemické redukce.
• Mapování disulfidových vazeb pro zajištění kvality biofarmaceutik.
• Rozšíření možností QA/QC a charakterizace proteoform v průmyslových i výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace s kapalinovou chromatografií online, zvýšení kapacity akumulace iontů, zdokonalení softwarové podpory a využití strojového učení pro rychlejší a automatizované zpracování dat. Platforma může být klíčová pro charakterizaci komplexních proteinů, biosimilars a nových terapeutických protilátek.

Závěr

Offline isCID-MSn workflow na timsOmni platformě nabízí robustní přístup k detailní analýze intactních proteinů a mAbs. Kombinace isCID, ECD/EID a RCID významně zvyšuje sekvenční pokrytí a umožňuje přesné mapování disulfidických vazeb, což je zásadní pro biofarmaceutické aplikace.

Reference

Nejsou uvedeny žádné externí literární zdroje.