MSⁿ Characterization of Chemical Modifications in Pharmaceutical Protein Byproducts Using the timsOmni Platform

Význam tématu

Analýza chemických modifikací vedlejších produktů farmaceutických proteinů je klíčová pro zajištění stability, účinnosti a bezpečnosti bioterapeutik. Mnohé z těchto modifikací se vyskytují v nízké abundanci, na malých nebo heterogenních proteinech a zahrnují chemicky podobné hmotnostní posuny, které činí jednoznačnou strukturální identifikaci obtížnou. Studie demonstruje, že pouhé využití intact-mass (MS1) často vede k nejasným nebo chybným závěrům a že cílené LC-MSⁿ workflow s komplementárními iontovými aktivačními technikami umožňuje místní lokalizaci modifikací a spolehlivé rozlišení blízkých chemických změn.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo aplikovat a ověřit cílené LC-MSⁿ protokoly na syntetických malých proteinových vedlejších produktech, které nesou více nízkoúrovňových chemických modifikací. Studie měla porovnat informace získané z MS1 s výsledky z víceúrovňové MS (MS²/MSⁿ) při použití kolizních i elektronových disociačních metod, vyhodnotit schopnost lokalizace modifikací a ukázat případy, kdy MS1 vede k chybné anotaci. Analytické příklady se týkaly dvou modelových proteinů (označených jako Protein A a Protein B).

Použitá metodika a instrumentace

• Separace: Reverzní fázová chromatografie na systému Elute+ LC (Bruker).
• Hmotnostní spektrometrie: timsOmni (Bruker) s možností cílených MSⁿ experimentů na časové ose LC.
• Iontová akumulace a aktivace: Omnitrap s dynamickou kontrolou akumulace iontů a definovanými dobami elektronového ozáření.
• Aktivační techniky: kombinace kolizních a elektronových metod včetně cCID, ECD, ECciD a EID; využití komplementárních CID + ExD strategií.
• Zpracování dat: OmniScape software pro systematické PTM screeningy, lokalizaci modifikací a validaci fragmentních spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

• Protein A: Reverzní fáze ukázala dvě chromatografické špičky odpovídající různým deamidacím. První špička byla MS² pomocí ECD/EID/CID/ECciD lokalizována na asparagin v C‑terminální oblasti; vícečlenné evidenční fragmenty podpořily tuto lokalizaci a poskytly lepší sekvenční pokrytí než MS1.
• Druhá špička u Protein A vykazovala fragmentační vzorce, které byly konzistentní s deamidací na dvou sousedních asparaginech v N‑terminální části. Fragmentační data naznačovala přítomnost směsi dvou proteoform, přičemž jednotlivé MS² techniky poskytly podobné skóre, což komplikuje jednoznačnou identifikaci bez zohlednění této heterogenity.
• Protein B: U pyroglutamylované formy byl pozorován dodatečný adukt +32 Da, který byl na základě MS1 zpočátku interpretován jako dioxidace. Podrobná analýza MS² fragmentů ukázala systematické ppm odchylky u fragmentů obsahujících dvě kyslíky. Přepočet a přehodnocení anotace vedlo k přeuspořádání modifikace na přírůstek síry odpovídající trisulfidovému můstku. Po této opravě se docílilo konzistentní hmotnostní přesnosti napříč fragmentním řetězcem, čímž byla potvrzena skutečná povaha modifikace (trisulfid) a zdůrazněna omezení spoléhat se pouze na MS1.
• Obecně elektronová disociace (ExD) přinesla diagnostické fragmenty a sekvenční informace, které nebyly dosažitelné jen pomocí CID nebo intact‑mass. Kombinované použití CID a ExD signifikantně zvýšilo důvěru v lokalizaci a identifikaci chemicky blízkých modifikací.

Přínosy a praktické využití metody

• Zavedení cílených LC‑MSⁿ protokolů na platformě timsOmni zvyšuje schopnost farmaceutických laboratoří spolehlivě identifikovat nízkoabundantní a jemně odlišné modifikace proteinů, které mohou ovlivnit kvalitu léčiv.
• ExD techniky (ECD, EID, ECciD) poskytují komplementární informace k CID a typicky zlepší sekvenční pokrytí v oblastech obsahujících modifikace, čímž umožňují místní lokalizaci PTM a rozlišení izobarických či isomerických variant.
• Detekce a korekce chyb MS1 anotací (např. zaměnění dioxidace za přidání síry) pomáhá zabránit mylným závěrům o degradačních drahách a vhodně podpoří rozhodování v QC/MAA procesech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace MSⁿ protokolů do rutinních QC workflow pro bioterapeutika s důrazem na automatizovanou detekci a validaci modifikací.
• Další rozvoj softwarových nástrojů pro automatizované rozpoznání chybových patternů (např. systematických ppm posunů asociovaných s konkrétními chemickými modifikacemi) a inteligentní přepis anotací.
• Využití iontové mobility (tims v timsOmni) pro další rozlišení konformačních či izobarických proteoform v kombinaci s MSⁿ.
• Zvýšení propustnosti metod vhodným nastavením cílených MSⁿ strategií pro LC‑běžné analýzy a standardizace protokolů pro průmyslové nasazení.
• Rozšíření aplikací na větší proteiny, komplexní směsi a na studie degradace v reálných formulacích léčiv.

Závěr

Cílené LC‑MSⁿ workflowy na platformě timsOmni s kombinací kolizních a elektronových disociačních technik poskytují výrazně lepší schopnost jednoznačné lokalizace a identifikace nízkoabundantních chemických modifikací než samotné MS1. Příklady v práci ukazují praktické případy, kdy MS² odhalila nesprávné MS1 přiřazení (dioxidace vs. trisulfid) a umožnila lokalizaci deamidací v heterogenních proteoformách. Takové přístupy mají přímý přínos pro farmaceutickou vývojovou a kontrolní praxi při mapování degradačních drah a zajištění kvality bioterapeutik.

Použitá instrumentace

• Elute+ LC (Bruker) – reverzní fázová separace.
• timsOmni MS (Bruker) – multi‑stage MS s Omnitrap pro dynamickou akumulaci iontů.
• Aktivační metody: cCID, ECD, ECciD, EID; kombinované CID + ExD protokoly.
• Software: OmniScape pro PTM screening, anotaci fragmentů a lokalizaci modifikací.

Reference

1. Haselmann KF, Kraner ME, Jensen H, Vinther TN, Smyrnakis A, Kosmopoulou M, Winkels K, Baluya D, Albers C, Papanastasiou D. MSⁿ Characterization of Chemical Modifications in Pharmaceutical Protein Byproducts Using the timsOmni Platform. Bruker Daltonics / Novo Nordisk collaboration; ASMS 2026 abstract.
2. Autorští a institucionální údaje: Novo Nordisk (Måløv, DK); Fasmatech Science and Technology (Athens, Greece); Bruker Daltonics GmbH & Co. KG; Bruker Scientific LLC (San Jose, CA); Bruker Daltonik GmbH (Bremen, Germany).