Studying protein and peptide non-covalent complexes with ion mobility and electron capture dissociation mass spectrometry

Význam tématu

Peptidové a proteinové nekovalentní oligomery ovlivňují buněčné procesy a představují běžné nečistoty v biotechnologickém vývoji léčiv. Jejich spolehlivé rozlišení a charakterizace jsou proto kritické pro výzkum mechanismů agregace, pro kontrolu kvality biofarmaceutik a pro design stabilních terapeutik. Kombinace iontové mobility (IM) a fragmentačních metod (zde včetně elektronové zachycovací disociace, ECD) umožňuje rozlišit izoformy, konforméry a různé úrovně oligomerizace, které nelze snadno oddělit pouze hmotnostní analýzou.

Cíle a přehled studie

Cílem předložené práce bylo využít IM-QTOF hmotnostní spektrometrii v kombinaci s kvadrupólovou izolací a ECD k: identifikaci a rozlišení oligomerů ubiquitinu a lipopeptidu liraglutidu; určení rozsahu oligomerizace za různých podmínek (nativní vs denaturované prostředí, koncentrace, inkubace); a posouzení použitelnosti IM+MS2 a ECD pro sekvenční pokrytí a strukturální informace u vybraných oligomerů.

Použitá instrumentace

• Agilent 6560 Ion Mobility Q-TOF upravený o ExD cell pro ECD.
• Driftový tubus (Drift Tube) s dusíkem jako nosným plynem pro iontovou mobilitu.
• Agilent statické nanospray ionizátory pro generování protonovaných iontů.
• Kvadrupól pro izolaci prekurzorů s možností nízkonárazové kolizní aktivace.
• Měřicí rozsah m/z 100–20 000.
• Softwarové nástroje: Agilent MassHunter Acquisition v11.0, ExDViewer v4.6.31, Mass Hunter Qualitative 12.0, Agilent IM-Browser 10.0; Excel pro zpracování CCS dat.

Použitá metodika

Vzorky: ubiquitin 1–74 (Sigma Aldrich), ubiquitin 1–76 (Bio‑Rad) a liraglutide (Sigma Aldrich) bez další purifikace. Příprava zahrnovala nativní podmínky (20 nebo 100 mM ammonium acetátu) a denaturující roztoky (15 % acetonitril, 0,1 % kyseliny mravenčí). Koncentrace se pohybovaly mezi 10–100 μM; liraglutide byl rovněž inkubován přes noc při 35 °C pro podporu oligomerizace. Ionizace probíhala statickým nanospray; k zachování oligomerů během desorpce byl použit tzv. low‑dry‑gas (sušící plyn) při pokojové teplotě a průtoku 1,5 L/min. Iontová mobilita s driftovým tubusem umožnila oddělení izobarických a konformačně rozdílných forem; kvadrupólová izolace s nízkou kolizní aktivací byla použita pro částečné „rozepsání“ oligomerů na menší komplexy a monomery. Pro některé prekurzory byla aplikována ECD k získání sekvenčních fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Ubiquitin: Denaturované podmínky vedly k vyšší míře oligomerizace než nativní stav. Vyšší koncentrace vzorku korelovala s vyšší úrovní oligomerizace. Fragmentace izolovaných oligomerů kvadrupólem generovala nižší‑řádové komplexy i monomery; fragmenty vykazovaly stejný drift time jako jejich prekurzory, což podporuje vztah mezi konformací a rozpadovými produkty.
• CCS (collision cross section): Při srovnání monomerů a dimerů se stejnými nábojovými stavy se zvyšující se nábojovostí rostlo CCS pro obě kategorie, což odpovídá více prodlouženým konformacím při vyšším náboji. Pro vyšší nábojové stavy byly dimery nalezeny s většími CCS než monomery kvůli delším driftovým časům.
• Liraglutide: Po inkubaci byla zjištěna rozsáhlá oligomerizace; monomerní forma měla maximálně 4+ náboj, zatímco oligomery se vyskytovaly v širokém spektru nábojových stavů. Analýza IM‑vybraných prekurzorů (zejména pro případy, kdy odlišné oligomerické stupně sdílely stejné m/z) umožnila jednoznačné přiřazení fragmentních iontů ke konkrétním prekurzorům. Pomocí MS2 analýzy oligomerů [n]n+ byla stanovena maximální pozorovaná úroveň oligomerizace n = 17 pro podmínky použitých příprav.
• ECD: ECD poskytlo očekávaná, dobře interpretablní data u monomerů ubiqitutinu i liraglutidu. U oligomerů však byla ECD aplikace komplikovaná tím, že izolace často vedla k disociaci oligomerů na nižší řády, což vytvářelo heterogenní směsi fragmentů a snižovalo čistotu ECD spekter pro jednoznačné sekvenční přiřazení.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrace iontové mobility s Q‑TOF a selektivní kvadrupólovou izolací poskytuje silný nástroj pro rozlišení konformací a oligomerických stavů, které jsou kritické v biotechnologickém vývoji a QC (např. detekce agregátů, stanovení stupně oligomerizace léčivých peptidů).
• Metodika umožňuje rozluštit komplikované MS1/MS2 situace, kdy rozdílné oligomery či konformery sdílejí podobné m/z hodnoty, a tím zvyšuje spolehlivost identifikací.
• ECD zůstává užitečnou technikou pro sekvenční informace monomerů při zachování posttranslačních modifikací, ale její aplikace na intaktní vyšší oligomery vyžaduje optimalizaci podmínek k zabránění předčasné disociaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zlepšení „gentle“ izolace a jemné aktivace: vývoj nižší‑energetických separačních protokolů a lepších ExD podmínek by mohl zachovat intaktní oligomery pro přímou ECD analýzu.
• Vyšší rozlišovací schopnost IM a multi‑dimenzionální přístupy (IM‑IM, vyšší rezoluce driftových metod) pro lepší separaci konformačních populací.
• Integrace s kvantitativními platformami pro rutinní QC v biopharma sektoru a sledování kinetiky oligomerizace během formulace a skladování.
• Pokročilé výpočetní metody pro korelaci CCS s atomistickými modely konformací a pro predikci rozpadových drah oligomerů při různých nábojových stavech.
• Možnost rozšíření na studium dalších agregujících peptidů/proteinů relevantních pro nemoci spojené s agregací a pro vývoj stabilních léčivých forem.

Závěr

Práce demonstruje, že kombinace iontové mobility, kvadrupólové izolace a cílené fragmentace umožňuje citlivou charakterizaci nekovalentních oligomerů proteinů a peptidů. Denaturační podmínky a vyšší koncentrace zvyšují úroveň oligomerizace ubiquitinu; liraglutide vykazuje velmi vysokou tendenci k oligomerizaci (až n = 17) za použitých podmínek. ECD je spolehlivá pro monomerní analýzu, zatímco pro oligomery je nutné řešit problematiku disociace během izolace, aby bylo možné získat čistá sekvenační data. Metoda má významný potenciál pro aplikace v analytice biopharmaceutik a strukturální proteomice.

Reference

• Y. V. Vasil’ev, R. Franklin. Studying protein and peptide non-covalent complexes with ion mobility and electron capture dissociation mass spectrometry. Poster reprint ASMS 2026, TP 388. Agilent Technologies, Inc., Corvallis, OR, USA.