Top-down Characterization of Intact Proteins via On-line Charge-stripping and Electron Capture Dissociation

Význam tématu

Metoda charakterizace intact proteinů top-down přístupem s využitím elektronové zachytové disociace (ECD) nabízí detailní pohled na primární strukturu proteinů bez předchozí enzymatické degradace. Kombinace online chemického odstraňování náboje (charge stripping) a ECD zlepšuje signálové intenzity a umožňuje úplné pokrytí sekvence i pro velké biomolekuly, což je klíčové pro proteomické analýzy, studium posttranslačních modifikací a biotechnologický i farmaceutický výzkum.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na zavedení mikro-kapkových reakcí v ionizačním zdroji k redukci počtu nábojových stavů denaturovaných proteinů. Hlavním cílem bylo:

• Koncentrovat signál do menšího počtu vysoce intenzivních iontů.
• Zlepšit efektivitu ECD fragmentace a sekvenční pokrytí intact proteinů.
• Ověřit vliv charge strippingu na strukturální stavy iontů pomocí ion mobility (IM) a kolizní aktivace (CIU).

Použitá instrumentace

Pro experimenty byly použity modifikované hmotnostní spektrometry Agilent 6560 IM Q-ToF a 6545XT AdvanceBio LC/Q-ToF vybavené druhou generací ExD buňky. Klíčové komponenty:

• ExD buňka se sedmi elektrostatickými čočkami, dvěma magnety a elektronovým vláknem řízeným ExD Control softwarem.
• Dual Agilent Jet Stream (AJS) zdroj se dvěma nebulizéry pro simultánní přívod proteinu a strippingového činidla.
• Možnost použití statického nanospray ion source pro měkčí podmínky injekce.

Použitá metodika

Proteiny (ubiquitin, cytochrom C, myoglobin, karbonická anhydráza a intact monoklonální protilátka) byly připraveny v denaturačním (15 % ACN, 0,1 % FA) a nativním prostředí (amoniakový acetát). Charge stripping probíhal v AJS zdroji infuzí dimethylaminopropylaminu v poměru 1 : 10 (voda) při rychlostech 0,01–0,2 µL/min. Primární proteiny se infundovaly 5–10 µL/min. Kolizní aktivace před ECD (CIU nebo CID) se prováděla úpravou napětí mezi kapilárou a fragmentátorem nebo kolizní buňkou. Analýza dat proběhla v IM MS Browser, ExDViewer a imsRealTime.

Hlavní výsledky a diskuse

Charge stripping vedlo k redukci širokého nábojového spektra denaturovaného ubiquitinu na několik převládajících nižších nábojových stavů (4+, 3+, 2+), což zvýšilo intenzitu a úplné sekvenční pokrytí až 100 % pro 3+ ionty. IM-MS ukázala, že nižší nábojové stavy z denaturačního prostředí zachovávají částečně rozvinutou strukturu, lišící se od nativních stavů; ty pak vykazovaly charakteristické driftové časy a fragmentační vzory odpovídající krystalografickým datům. CIU studie potvrdily závislost strukturální stability na nábojovém stavu a na podmínkách kolizní aktivace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Rychlou a vysoce citlivou analýzu intact proteinů bez enzymatického štěpení.
• Detailní mapování modifikací a variant v proteinech farmaceutického významu (např. mAb).
• Studium strukturálních přechodů v plynné fázi propojením IM-MS a ECD.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikace na proteomické profily komplexních vzorků, integrace s vysokorozlišovacími spektrometry a automatizace charge strippingu. Dalším krokem je kombinace s dalšími ExD metodami (ETD) a rozvoj softwarového zpracování pro rychlé vyhodnocení modifikací a interakcí proteinů.

Závěr

On-line chemické odstraňování náboje v ESI zdroji ve spojení s ECD nabízí účinnou cestu k plnému sekvenčnímu pokrytí intact proteinů. Metoda zvyšuje signálovou intenzitu, podporuje studium strukturálních stavů v plynné fázi a má široký potenciál v proteomice a biotechnologii.

Reference

1. Zhang et al. Native electrospray ionization and electron-capture dissociation for comparison of protein structure in solution and the gas phase. Int J Mass Spectrom, 2013, 354-355.