In-Source Charge Reduction Enhances Top-Down Characterization of Denatured Proteins

Význam tématu

Denaturované proteiny poskytují podstatně lepší pokrytí aminokyselinové sekvence při top-down spektrometrii, ovšem široké rozložení nábojových stavů vede k nízké intenzitě jednotlivých prekurzorů a ke kongesti spekter MS/MS. Řízené snížení nábojového stavu přímo ve zdroji může sjednotit nábojový obal na hodnoty podobné nativním, uvolnit prostor ve spektrech a zvýšit citlivost fragmentační analýzy bez použití solných pufrů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat, že in-source chemická redukce náboje umožňuje standardizované řízení nábojových stavů denaturovaných proteinů a vede k lepší top-down charakterizaci. Experimenty byly provedeny na vzorcích ubiquitinu, karboanhydrázy, sérového albuminu a standardním mixu proteinů. Systém využívá dvojitý AJS elektrosprej s donosnou aplikací báze dimethylaminopropylaminu k modulatoru nábojového rozložení.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky lyofilizovaných proteinů rehydratovaných v 15 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí (denaturované) nebo 100 mM octanu amonného (nativní). Analýza probíhala buď přímou infuzí nebo reverzní fázovou LC (PLRP-S kolona) na Agilent 1290 Infinity II Bio LC.
In-source charge reduction se realizovala infuzí dimethylaminopropylaminu druhým nebulizérem. Top-down fragmentace byla prováděna ECD v Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s ExD buňkou. Ion mobility měření s driftovou trubicí na Agilent 6560 IM LC/Q-TOF s dusíkem. Software: MassHunter Acquisition v11.0, ExDViewer v4.6.12, Qualitative Analysis v12.0, IM Browser v10.0, Excel pro grafy CCS.

Hlavní výsledky a diskuse

In-source redukce nábojového stavu značně dekongestovala MS1 i MS2 spektra při přímé infuzi i denaturované chromatografii. U karboanhydrázy se čistší MS2 spektra u nižších nábojů projevila vyššími IonScores. Kombinací ECD dat z prekurzorů 16+, 22+ a 29+ bylo dosaženo 78 % pokrytí sekvence, tedy výrazného zlepšení oproti každému stavu zvlášť.
Ion mobility ukázala, že po reakci s bází si proteiny udržují prodlouženou konformaci odpovídající maximálně unfoldingu dosaženému CIU. U větších proteinů (BSA, AG) je tato prodloužená struktura stabilnější a přetrvává delší dobu ve spektru.

Přínosy a praktické využití metody

• Přesné řízení nábojového rozložení bez solného pufru.
• Kompatibilita s přímou infuzí i běžnou denaturací v LC.
• Vyšší signál-šum a lepší IonScores fragmentačních spekter.
• Možnost kombinovat rozličné nábojové stavy pro rozšíření sekvenčního pokrytí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace řízení dávkování báze pro kontinuální optimalizaci nábojových stavů.
• Srovnání různých chemických reaktantů pro in-source modifikaci náboje.
• Rozšíření na studium posttranslačních modifikací a složitých proteinových komplexů.
• Propojení s dalšími aktivacemi (CID, UVPD) pro komplexní top-down mapování.

Závěr

In-source chemická redukce náboje nabízí jednoduchý a efektivní způsob, jak zlepšit top-down charakterizaci denaturovaných proteinů. Metoda poskytuje nativní-like nábojové stavy, čistí spektra, zachovává prodloužené struktury a umožňuje dosažení vyššího pokrytí sekvence bez nutnosti solných pufrů.

Reference

1. Ugrin SA, English AM, Syka JEP et al. Ion–Ion Proton Transfer and Parallel Ion Parking for the Analysis of Mixtures of Intact Proteins on a Modified Orbitrap Mass Analyzer. J Am Soc Mass Spectrom. 2019;30:2163–2173.
2. Lieu LB, Hinkle JD, Syka JEP, Fornelli L. Leveraging Ion–Ion and Ion–Photon Activation to Improve the Sequencing of Proteins Carrying Multiple Disulfide Bonds: The Human Serum Albumin Case Study. J Am Soc Mass Spectrom. 2024;35(12):3265–3273.