Top-Down Sequence Analysis of Intact Proteins Using an Agilent AdvanceBio 6545XT LC/Q-TOF with ExD

Význam tématu

Proteoformy představují specifické formy proteinů lišící se sekvencí a posttranslačními modifikacemi, které ovlivňují jejich funkci v biologických procesech.
Top-down proteomika umožňuje analýzu intact proteinů bez rozštěpení na peptidy a uchovává informaci o jednotlivých proteoformách, což je klíčové pro biotechnologický výzkum a vývoj léčiv.

Cíle a přehled studie

Ukázat implementaci top-down fragmentace intact proteinů na LC/Q-TOF přístroji Agilent 6545XT AdvanceBio se zabudovanou ExD buňkou pro elektronový capture dissociation (ECD).
Prozkoumat vliv kolizní energie, spojení ECD s CID a průměrování spekter na sekvenční pokrytí a detekci fragmentů.

Použitá instrumentace

• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s ExD buňkou pro ECD (part number G6549AA + G1997AA)
• Agilent AJS (Dual Jet Stream) zdroj (G1959A)
• ExDControl v3.7.8, MassHunter Data Acquisition v11.0 Update 2, ExDViewer v4.6.28
• Standardní chemikálie a ladicí standardy: ESI-L tuning mix, formic acid, acetonitril, voda, ubiquitin, carbonic anhydrase, aldolase, enolase

Použitá metodika

• Přímá infuze denaturovaných proteinových vzorků (1–10 µM) v 15 % acetonitrilu a 0,1 % formické kyseliny rychlostí 10–20 µL/min
• Targeted MS/MS metoda v MassHunter: ECD bez kolizní energie (0 V) i s přídavnou CID (10–60 V), izolace vybraných nábojových stavů
• Optimalizace filamentového proudu, ExD ladicích profilů pro přenos proteinu a ECD fragmentaci pomocí ExDControl autotunů
• Průměrování 47 spekter pro zvýšení poměru signál/šum, vyhodnocení a dekonvoluce fragmentů v ExDViewer

Hlavní výsledky a diskuse

• Ubiquitin (8,6 kDa, 11+): 100 % pokrytí sekvence, 166 unikátních ECD fragmentů bez dodatečné CID energie.
• Carbonic anhydrase (29 kDa, 26+): pouze ECD (0 V) 50 % pokrytí, s 10 V CID 62 % pokrytí a 156 fragmentů, maximální CID-only 41 %.
• Aldolase (39 kDa, 29+): optimální ECD + 40 V CID dosáhlo 38 % pokrytí.
• Enolase (46 kDa, 40+): optimální ECD + 40 V CID dosáhlo 23 % pokrytí.
• Spektrální průměrování zlepšuje detekci fragmentů, avšak marginalní zisky klesají s větším počtem spekter.
• Reprodukovatelnost sekvenčního pokrytí pro carbonic anhydrase (7 měření v průběhu 52 dní): průměr ±2,15 %.

Přínosy a praktické využití metody

Top-down LC/Q-TOF workflow na dostupné platformě nabízí detailní charakterizaci proteoform jako kritický QC atribut bioterapeutik.
Rychlá a uživatelsky přívětivá optimalizace ECD/CID podmínek usnadňuje implementaci v rutině výzkumu, QA/QC a průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření inline LC separace intact proteinů a nativních komplexů.
Integrace pokročilých elektronových technik (ETD, EThcD) a umělé inteligence pro predikci ideálních fragmentačních parametrů.
Vývoj rychlých bioinformatických nástrojů pro automatizovanou anotaci a kvantifikaci proteoform.

Závěr

Prokázali jsme praktickou implementaci top-down fragmentace intact proteinů na Agilent 6545XT LC/Q-TOF s ExD buňkou, která poskytuje vysoké a reprodukovatelné sekvenční pokrytí klíčových biotechnologických proteinů.
Optimalizace ECD a doplňkové CID energie významně rozšiřuje schopnosti metody pro detailní proteoformální analýzu.

Reference

• Smith L.; Kelleher N.; The Consortium for Top-Down Proteomics. Proteoform: A Single Term Describing Protein Complexity. Nature Methods 2013, 10(3):186–187.
• Smith L. M.; et al. The Human Proteoform Project: Defining the Human Proteome. Science Advances 2021, 7(50):eabk0734.
• Keenan E. K.; et al. Discovering the Landscape of Protein Modifications. Molecular Cell 2021, 81(9):1868–1878.
• Lutomski C. A.; et al. Multiple Roles of SARS-CoV-2 N Protein Facilitated by Proteoform-Specific Interactions with RNA, Host Proteins, and Convalescent Antibodies. JACS Au 2021, 1(8):1147–1157.
• Roberts D. S.; et al. Top-Down Proteomics. Nature Reviews Methods Primers 2024, 4:38.
• Adams L. M.; et al. Mapping the KRAS Proteoform Landscape in Colorectal Cancer Identifies Truncated KRAS4B That Decreases MAPK Signaling. Journal of Biological Chemistry 2023, 299(1):102768.
• Fulcher J. M.; et al. Discovery of Proteoforms Associated with Alzheimer's Disease Through Quantitative Top-Down Proteomics. Molecular and Cellular Proteomics 2024, 24(6):100983.
• Chapman E. A.; et al. Native Top-Down Mass Spectrometry for Characterizing Sarcomeric Proteins Directly from Cardiac Tissue Lysate. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2024, 35(4):738–745.
• Beckman J. S.; et al. Improved Protein and PTM Characterization with a Practical Electron-Based Fragmentation on Q-TOF Instruments. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2021, 32(8):2081–2091.
• Gadkari V. V.; et al. Enhanced Collision Induced Unfolding and Electron Capture Dissociation of Native-Like Protein Ions. Analytical Chemistry 2020, 92(23):15489–15496.