Extending the mass limit of collision cross sections of proteins in Orbitrap analyzers through kinetic energy and fragmentation behavior analysis

Význam tématu

Analýza kolizních průřezů proteinů (CCS) v plynném stavu poskytuje klíčové informace o jejich prostorovém uspořádání, které ovlivňuje ligandové vazby, enzymatickou aktivitu a tvorbu komplexů. Tradičně se CCS měří v iontových mobilitních buňkách, nově však lze tyto parametry získat přímo v Orbitrap analyzátorech tím, že se vyhodnocuje dekrementace amplitudy iontového paketu vlivem srážek s neutrálními molekulami.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je rozšířit rozsah hmotností proteinů, jejichž CCS lze přesně měřit v Orbitrap analyzátoru, až do 50 kDa při zachování nativních podmínek. Autoři zkoumali vliv kinetické energie iontů a jejich chování při srážkách na přesnost stanovení CCS a stanovili limity hmotnosti a náboje, pro které je metoda aplikovatelná.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda spočívá v injekci iontového paketu do Orbitrapu, kde dochází ke kolizím s N₂ a postupnému prohlubování dekoherence paketu, což se projeví poklesem amplitudy ve více tepelných peri­odách („beats“). Pomocí Fourierovy transformace a inverzní FFT se získá koeficient poklesu c, z něhož po kalibraci na standardní ionty vypočítáme CCS.

• Ionizace: elektrosprejová ionizace (ESI)
• Vedení a uchovávání iontů: kvadrupól, C-trap, kolizní buňka
• Analytický analyzátor: modifikovaný Q Exactive High Field Orbitrap
• Analýza dat: FFT/iFFT, kalibrace s ionty známého CCS

Hlavní výsledky a diskuse

• U menších proteinů (<16 kDa) a vyšších nábojových stavů je shoda Orbitrap CCS s hodnotami z iontové mobility velmi dobrá.
• Při měření větších proteinů (20–50 kDa) v nízkých nábojových stavech dochází k systematickému pod­hodnocení CCS, protože při nižší kinetické energii část iontů přežívá kolize bez ztráty koherence.
• Chybovost stanovení CCS roste se zvyšující se hmotností a klesajícím nábojem iontu.
• Lineární regrese umožnila určit prahové kinetické energie pro zajištění úplné dekoherence po jedné kolizi, které korelují s molekulovou hmotností proteinu.

Přínosy a praktické využití metody

Díky Orbitrap CCS lze integrovat strukturní informace přímo do hmotnostně-spektrometrických analýz bez nutnosti samostatných mobilitních experimentů. Metoda je vhodná pro studium nativních proteinových komplexů a polymerizací v reálných podmínkách a zkracuje analytickou cestu v proteomice, biotechnologii i farmaceutickém vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na megadaltonové komplexy a virové částice za použití detekce jednotlivých iontů.
• Detailní studium termální stability a energetiky vazeb protein–protein ve vakuu Orbitrapu.
• Integrace CCS dat z Orbitrapu do výpočetních modelů prostorové konformace a strojového učení.

Závěr

Orbitrap CCS metoda poskytuje spolehlivé rozšíření analýzy kolizních průřezů proteinů až do ~50 kDa za předpokladu dostatečného počtu tepe­lových peri­od a kinetické energie iontů nad prahovou hodnotou. Nízké nábojové stavy a vyšší molekulová hmotnost vyžadují pečlivou optimalizaci podmínek, aby nedocházelo k podhodnocení CCS.

Reference

1. Sanders J. D. et al. Determination of Collision Cross-Sections of Protein Ions in an Orbitrap Mass Analyzer. Anal. Chem. 2018, 90(9):5896–5902.
2. Makarov A.; Denisov E. Dynamics of Ions of Intact Proteins in the Orbitrap Mass Analyzer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2009, 20(8):1486–1495.
3. Bush M. F. et al. Collision Cross Sections of Proteins Measured by Ion Mobility and Orbitrap. Anal. Chem. 2010, 82(22):9557–9565.
4. Wörner T. P. et al. Frequency Chasing of Individual Megadalton Ions in an Orbitrap Analyzer. bioRxiv 2021, 2021.06.15.448530.