Effect of column chemistry, temperature, inert flow path, and mobile phase on the separation of GLP-1 peptides and their impurities

Shrnutí posteru: Vliv chemie kolon, teploty, inertního průtoku a mobilní fáze na separaci GLP-1 peptidů a jejich nečistot

Význam tématu

Rychlé rozšíření GLP-1 receptorových agonistů (např. semaglutid, tirzepatid, liraglutid) v klinické praxi a průmyslu klade vysoké nároky na kvalitativní a kvantitativní profilování nečistot. Tyto peptidové léčivé látky mohou obsahovat velmi nízkoúrovňové nečistoty, které se liší jen drobnými strukturálními změnami (stereoisomery, výpadky nebo vložení jedné aminokyseliny, lokalizovaná oxidace). Proto je nezbytná vysokorychlostní a vysokorozlišení chromatografie pro spolehlivou kvantifikaci pomocí LC‑UV a jednoznačnou detekci pomocí LC‑MS.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo systematicky vyhodnotit vliv mobilní fáze (typ a koncentrace přísad), chemie stacionární fáze (různé C18 a nabité C18), teploty kolonového prostoru, inertního hardware (bio‑inertní průtoková cesta) a zatížení vzorkem na separaci náročných nečistot u semaglutidu, liraglutidu a tirzepatidu. Studie využila syntetické panely nečistot pro porovnání selektivity a kvality špiček mezi různými podmínkami.

Použitá metodika

Výzkum proběhl za použití reverzní fáze HPLC s detekcí DAD a doplňkově MS pro selektivní monitorování. Pro rychlou optimalizaci složení mobilní fáze byla použita funkce Blend Assist, která umožňuje měnit koncentrace přísad bez přípravy více lahví. Hodnotily se zejména vlivy:

• typy přísad v mobilní fázi (trifluoroctová kyselina, formiátová kyselina, pufry jako NH4OAc),
• koncentrace TFA (série 0,05–0,5 %) a jejich dopad na tvar špiček a rozlišení,
• teplota kolonového prostoru (40–80 °C) s hledáním optimální kompromisní hodnoty,
• chemie kolon (povrchově pórovité částice, nabité C18 vs tradiční C18),
• síla vzorku (nabití kolony) a její vliv na selectivitu a tvar špiček.

Použitá instrumentace

Hlavní přístrojové vybavení a konfigurace:

• Agilent 1290 Infinity II Bio Flexible Pump LC s DAD (bio‑inert Max‑Light cartridge cell) a Pro iQ Plus MS nebo Agilent 1290 Infinity II Flexible Pump s DAD a 6470 QQQ MS.
• ESI zdroj Agilent Jet Stream v pozitivním režimu s optimalizovanými průtoky a teplotami pro citlivou detekci peptidů.
• Testované kolony (vše 2.1 x 150 mm): Altura Peptide Plus (nabité C18, superficially porous), AdvanceBio Peptide Plus, AdvanceBio Peptide Mapping, InfinityLab Poroshell EC‑C18 1.9 µm, ZORBAX Eclipse Plus 1.8 µm.
• Mobilní fáze experimenty zahrnovaly kombinace vody, acetonitrilu, TFA (0,05–0,5 %) a 50 mM NH4OAc v různých směsích; průtok 0,5 mL/min, injekční objem 1 µL, autosampler 10 °C, DAD monitorování na 220 nebo 280 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění z vyhodnocení separací:

• TFA vs FA: Trifluoroctová kyselina výrazně překonala formiátovou kyselinu v tvaru špiček, počtu separovaných nečistot a stabilitě UV baseliny pro semaglutid i liraglutid.
• Koncentrace TFA: Optimální koncentrace jsou závislé na konkrétním analytu – semaglutid vykazoval nejlepší separaci kolem 0,4 % TFA, zatímco liraglutid preferoval mnohem nižší hodnoty (~0,05 %). Změna koncentrace TFA zásadně ovlivnila retenci a rozlišení stereoisomerů.
• Chemie kolony: Slitěné (superficially porous) částice s pozitivně nabitou povrchovou úpravou (Altura Peptide Plus) poskytly lepší tvar špiček, vyšší kapacitu a lepší selektivitu vůči blízkým strukturálním nečistotám než konvenční C18. V některých případech nabitá C18 umožnila také provoz při vyšším pH pro alternativní selektivitu.
• Teplota kolonového prostoru: Teplota měla silný vliv na selektivitu. Celkově byla pro oba peptidy nejvýhodnější 60 °C; vyšší teploty snižovaly rozlišení semaglutidových nečistot vůči hlavní špičce, zatímco některé lira‑nečistoty výrazně měnily retenci s teplotou (např. Kyn(31)).
• Zatížení vzorku: Vyšší naložení mělo negativní dopad především na separation liraglutidu, což může být buď vlastností molekuly, nebo důsledkem nižší koncentrace TFA aplikované pro tento analyzovaný systém.
• Bufrované mobilní fáze: Ammonium‑acetátový pufr (pH ≈ 7, 40 mM) nezlepšil separaci semaglutidu a liraglutidu oproti TFA, avšak poskytl významné zlepšení separace u tirzepatidu, včetně změny pořadí retence stereoisomerů.

Přínosy a praktické využití metody

Studie ukazuje konkrétní strategie pro robustní impurity profiling peptidových léčiv:

• Použití správného typu přísady a její optimalizované koncentrace (zejména TFA) je často rozhodující pro rozlišení blízce příbuzných peptidových nečistot.
• Nabitá pozitivní C18 fáze s superficially porous částicemi (Altura Peptide Plus) poskytuje kombinaci lepší selektivity, tvaru špiček a vyššího zatížitelného množství, což zvyšuje robustnost metod pro QC i výzkum.
• Kontrola teploty kolony a použití nástrojů pro rychlou optimalizaci (Blend Assist) urychlí vývoj metod a sníží počet experimentálních běhů.
• Pro každou peptidovou látku je nutné provést individuální optimalizaci; univerzální podmínky neexistují.

Budoucí trendy a možnosti využití

Na základě výsledků lze očekávat několik směrů dalšího rozvoje:

• Rozšířené využití nabitých peptidových fází a povrchově pórovitých částic při vývoji QC metod pro peptidová léčiva.
• Integrace metodiky rychlého screeningu přísad mobilní fáze a teplotních map pro automatizovaný návrh optimálních metod.
• Další studium kombinací pH‑řízených pufrů a organických modifierů pro specifické analýzy, zejména u molekul jako tirzepatid, kde pH silně ovlivňuje selektivitu.
• Využití pokročilých LC‑MS režimů a selektivních přístupů (SIM, MRM) v kombinaci s optimalizovanou chromatografií pro zvýšení citlivosti a přesnosti sledování trace‑nečistot.

Závěr

Systémové hodnocení složení mobilní fáze, její koncentrace a teploty kolony přináší výrazné zlepšení v separaci těžko rozlišitelných peptidových stereoisomerů a dalších blízce příbuzných nečistot. Nabité C18 kolony založené na superficially porous částicích (Altura Peptide Plus) v této studii nabídly nejlepší kombinaci rozlišení a zatížitelnosti. Pro každý GLP‑1 analóg je však nutné provést cílenou optimalizaci parametrů metody, přičemž blendovací nástroje a pufrované mobilní fáze rozšiřují možnosti selektivity zejména u některých peptidů jako tirzepatid.

Reference

Poster Reprint, ASMS 2026 ThP 213. Autoři: Ace G. Galermo a kol. (Agilent Technologies, různé lokality). Effect of column chemistry, temperature, inert flow path, and mobile phase on the separation of GLP‑1 peptides and their impurities. Publikováno v USA, 10. června 2026.