Workflows for GLP-1 Receptor Agonists and Therapeutic Peptides: Identity, Impurity, Bioanalysis, and Stability Testing

Workflowy a praktické přístupy pro analýzu GLP-1 receptor agonistů a terapeutických peptidů

Význam tématu

Peptidová léčiva, zejména GLP-1 receptor agonisté (semaglutid, tirzepatid, exenatid apod.), představují rychle rostoucí segment farmacie díky své účinnosti v léčbě diabetu 2. typu a obezity. Vzhledem k rostoucí komplexitě chemických modifikací (lipidace, ochranné skupiny, konjugace) a požadavkům regulace je nezbytné mít spolehlivé, škálovatelné analytické postupy pro ověření identity surovin, profilování nečistot, bioanalytiku a hodnocení stability.

Cíle a přehled studie / článku

Shromážděný materiál shrnuje aplikační poznámky a pracovní postupy od Agilentu a partnerů zaměřené na: ověření surovin bez otevření obalů, ortogonální separace nečistot pomocí HILIC‑MS, souběžnou analýzu excipientů (DAD+ELSD), automatizovanou a citlivou bioanalytiku (AssayMAP + LC/TQ), zvýšenou citlivost analytiky UV‑Vis (druhá derivace) a integrované strukturální / funkční charakterizace (LC/Q‑TOF + SPR). Cílem je nabídnout praktické workflowy pro R&D i QC/QA laboratoře.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika (souhrn):

• Identifikace surovin: spatially offset Raman spectroscopy (SORS) pro neinvazivní identifikaci Fmoc‑ochranných aminokyselin přímo skrz HDPE/amber lahve.
• Purita a profil nečistot: HILIC separace (zwitterionická HILIC‑Z fáze) spojená s DAD, ELSD a single‑quadrupole nebo Q‑TOF MS pro identifikaci a dekonvoluci m/z obálky (molární hmotnosti). Odstranění/neutralizace ocelových komponent pro snížení adsorpce.
• Bioanalytika: automatizované čistění (AssayMAP RP‑S) kombinované s triple quadrupole LC/MS (6495D) pro kvantifikaci semaglutidu (LLOQ 0,2 ng/mL z 100 μL) a tirzepatidu (LLOQ 0,05 ng/mL z 100 μL). Validace linearity, přesnosti a opakovatelnosti.
• Stability & charakterizace degradantů: oxidativní stres (H2O2), LC/Q‑TOF pro přesné přiřazení adicí +16/+32 Da, UV‑Vis druhá derivace (Cary 3500 Multicell) pro rychlé rozlišení změn aromatických zbytků (Trp, Tyr, Phe) a SPR pro měření vazebné aktivity vůči GLP‑1 receptoru.

Použitá instrumentace

• Agilent Vaya Raman (SORS) – průzkum surovin bez otevírání obalů.
• Agilent 1290 Infinity III Bio LC, Agilent 1290 Infinity II Bio LC – biokompatibilní nízko‑adsorpční LC systémy.
• Agilent Altura Poroshell HILIC‑Z a InfinityLab/Altura Poroshell HILIC‑Z kolony s Ultra Inert hardware.
• Agilent InfinityLab LC/MSD iQ (single quadrupole), Pro iQ Plus single quadrupole MS – ekonomická MS detekce v QC.
• Agilent 6495D triple quadrupole LC/TQ s AdvanceBio kolonou – kvantitativní MRM analýzy (semaglutid, tirzepatid).
• Agilent AssayMAP Bravo – automatizované RP‑S cartridge čištění vzorků (x5 zvýšení citlivosti oproti pouze precipitaci).
• Agilent Cary 3500 Multicell UV‑Vis s vestavěnou funkcí druhé derivace – rychlé screenování oxidace aromatických zbytků.
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF – vysokorozlišující identifikace oxidačních forem a modifikací.
• Nicoya Digital SPR (16‑kanálů) – měření kinetiky vazby GLP‑1R (ka, kd, KD) pro korelaci struktura–funkce.

Hlavní výsledky a diskuse

• Raw materials: Vaya SORS jednoznačně rozlišil Fmoc‑ochranné aminokyseliny skrz HDPE a amber lahve během ~40 s, což minimalizuje expozici surovin světlu/aeru a riziko kontaminace.
• HILIC‑MS impurity profiling: HILIC‑Z metoda poskytla ortogonální selektivitu k RPLC; kombinace s MS umožnila detekci a přiřazení nečistot (přídavek aminokyselin, truncace, cyklizace, oxidace). Příklady: u tirzepatidu identifikován impurity s +163 Da (přidání Tyr); u semaglutidu nízkonivové izomery a truncace; u exenatidu oxidace Met (+16 Da) rozdělená do diastereomerních špiček.
• Vliv nízko‑adsorpčního flow path: eliminace nebo pasivace ocelových částí + Ultra Inert kolony výrazně zlepšily tvar píku, recovery a reprodukovatelnost (zejména pro iontické/excipienty jako fosfát) a zvýšily citlivost na stopové nečistoty.
• Bioanalytika – AssayMAP + 6495D: automatizované RP‑S čištění zvýšilo citlivost ~5× oproti jednoduché proteinové precipitaci. Semaglutid: LLOQ 0,2 ng/mL (100 μL). Tirzepatid: LLOQ 0,05 ng/mL (100 μL). Metody prokázaly linearitu do 1 000 ng/mL, dobré intraday/interday CV a bias v rámci regulatorních kritérií.
• UV‑Vis 2. derivace: Cary 3500 Multicell zpřehlednil drobné změny v absorpčních profilech aromatických zbytků; oxidace Trp detekována jako snížení signálu v ~291 nm oblasti, výsledky potvrzeny LC‑Q‑TOF (mono/di oxidace +16/+32 Da).
• Pro iQ Plus single‑quad LC/MS pro stability: systém detekoval stopové oxidované formy tirzepatidu (např. +32 Da, +4 Da) a neznámé impurity (~+124 Da). Četnost degradace byla závislá na pH a čase (nejméně stabilní pH 5 při 5 °C).
• Integrovaná struktura–funkce (LC/MS + SPR): u liraglutidu oxidace neovlivnila vazebnou afinitu k receptoru (podobné KD), zatímco proteolytické štěpení (chymotrypsin) zcela potlačilo vazbu — důraz na to, že strukturální změny nemusí vždy korelovat s funkčním dopadem.

Přínosy a praktické využití metody

• Neinvazivní surovinová kontrola (SORS) zrychluje a zabezpečuje příjem surovin do výrobních linek.
• HILIC‑MS s nízko‑adsorpčním hardware zvyšuje schopnost separace a detekce produkt‑souvisejících nečistot a excipientů (důležité pro lot release a stability).
• Automatizované čistění vzorků (AssayMAP) umožňuje vysokou průchodnost a citlivou bioanalytiku bez nutnosti vyvíjet protilátkové LIS assay pro každý analog.
• UV‑Vis druhá derivace nabízí rychlý screening oxidačních změn před složitějšími LC‑MS analýzami, šetří vzorky i čas.
• Single‑quad MS (Pro iQ Plus) nabízí ekonomickou, citlivou alternativu vhodnou pro rutinní QC/QA nasazení.
• Integrované platformy (LC/Q‑TOF + SPR) dovolují přímé propojení chemických modifikací s vazebnou aktivitou, což je klíčové při hodnocení rizika degradantů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvyšování automatizace a standardizace přípravných kroků (AssayMAP a podobné) pro vysokopropustné bioanalytické laboratoře.
• Rozšířené používání nízko‑adsorpčních/Ultra Inert komponent v LC průtoku jako standard pro peptidy citlivé na kovovou adsorpci.
• Integrace ortogonálních separací (HILIC + RPLC) v multidimenzionálních nastaveních pro komplexní impurity‑profilování.
• Větší adopce cenově dostupných MS systémů s robustní dekonvolucí (single quad s lepším softwarem) pro QC laboratoře.
• Více případů využití kombinovaných analytik (MS + SPR) pro rychlé hodnocení struktur‑funkce v early‑stage screeningu i stability.

Závěr

Přehled ukazuje, že kombinace neinvazivních identifikačních technik, ortogonálních chromatografických metod, nízko‑adsorpční konfigurace, automatizovaného vzorkování a citlivé MS/SPR analytiky vytváří robustní sadu nástrojů pro vývoj, kontrolu kvality a stabilitu peptidových léků. Tyto workflowy pomáhají rychle a spolehlivě identifikovat suroviny, kvantifikovat účinné látky v biologických matricích, detekovat a charakterizovat nízkonivové degradanty a přenést výsledky do praktického rozhodování v procesu vývoje a výroby.

Reference

1. Prullière F., Welsby C. Differentiating Biopharmaceutical Raw Materials Using Spatially Offset Raman Spectroscopy. Agilent Technologies application note, 2021.
2. Alvarez P., Lecluyse C., Vandendriessche I., Sandra P., Sandra K., Schneider S., Huber U. HILIC Analysis of GLP‑1 Receptor Agonists Using an Agilent 1290 Infinity III Bio LC with DAD and ELSD. Agilent application note, 2025.
3. McCalley D. V. Understanding and Manipulating the Separation in Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A 2017, 1523, 49–71.
4. Guimaraes G. J., Bartlett M. G. Managing Nonspecific Adsorption to Liquid Chromatography Hardware: a Review. Anal. Chim. Acta 2023, 1250, 340994.
5. EMA Draft guideline on the development and manufacture of synthetic peptides; EMA/CHMP/CVMP/QWP/387541/2023.
6. Ozempic – Semaglutide injection, DailyMed (product information), 2021; Wegovy – semaglutide injection, 2021; Mounjaro/Zepbound – tirzepatide product information, 2022–2023.
7. Suresh Babu C. V. Enhanced Peptide Characterization and Stability Assessment Using UV‑Visible Second‑Derivative Spectroscopy on an Agilent Cary 3500 Multicell UV‑Vis Spectrophotometer. Agilent application note, 2025.
8. Wang J., et al. Mechanistic Study of Diketopiperazine Formation during Solid‑Phase Peptide Synthesis of Tirzepatide. ACS Omega 2022, 7, 46809–46824.
9. Datola A., et al. Characterization by LC‑MS/MS of Oxidized Products Identified in Synthetic Peptides Submitted to Forced Oxidative Stress. J. Mass Spectrom. 2023, 58(5), e4919.
10. Badgujar D., Bawake S., Sharma N. Identification and Characterization of Major Degradation Products of Synthetic Liraglutide Using LC‑HRMS. J. Pept. Sci. 2025, 31, e3652.