A novel monodisperse supermacroporous reversed-phase platform for comprehensive nucleic acid analysis across a broad size range

Význam tématu

Analýza nukleových kyselin je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality moderních terapeutik, zahrnujících krátké oligonukleotidy, siRNA, sgRNA, tRNA a dlouhé mRNA. Různorodost velikosti a struktur těchto molekul ztěžuje chromatografické metody: materiály a kolony optimalizované pro malé sekvence často selhávají u větších konstrukcí a naopak. Univerzální, reprodukovatelná separační platforma, která zajistí vysoké rozlišení přes široké rozpětí velikostí, zjednodušuje analytické workflow, zkracuje časy vývoje metod a snižuje potřebu více specializovaných kolon.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat reverzně-fázovou separační platformu založenou na novém monodisperzním supermakroporézním (SMP) polymerním stacionárním článku o velikosti částic 2,5 µm (SurePac Oligo RP MDi). Platforma měla ukázat schopnost jednotně separovat nukleové kyseliny napříč širokým rozsahem velikostí — od 20–25 bp siRNA přes ~75 nt tRNA a ~100 nt sgRNA až po velké mRNA (1 000–3 000 nt) — a zároveň být kompatibilní s LC–MS workflow.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Reverzně-fázová LC (RP-LC) s různými mobilními fázemi včetně TEAA/acetonitril, HAA/acetonitril a HFIP/DBA/methanol pro podporu LC–MS.
• Vyhodnocení rozlišení, tvaru píků, separace nečistot a přístupnosti pórů na sadě referenčních vzorků: 8-kombo ssDNA (12–40 mer), siRNA (21 bp), sgRNA (~100 nt), tRNAPHE (~75 nt) a 1960 nt mRNA.
• Posouzení přenositelnosti metod a lot-to-lot reprodukovatelnosti pomocí tří různých lotů kolony SurePac Oligo RP MDi.
• Hodnocení carryover měřením blank běhu po injekci mRNA.

Instrumentace:

• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC pro LC–UV experimenty.
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC (P/N VN-S10-A-01) použitý v LC–MS experimentech.
• Thermo Scientific Orbitrap Ascend Tribrid vysoko-rozlišovací hmotnostní spektrometr pro LC–MS (negativní iontový režim).
• Software: Chromeleon 7.2.10 pro LC–UV, Xcalibur 4.7, Thermo Freestyle 1.8 a BioPharma Finder 5.3 pro MS analýzu a dekonvoluci.
• Kolony: SurePac Oligo RP MDi 2.5 µm, 2.1×50 mm (P/N 43712-052132) a 0.3×50 mm (P/N 43712-050332); komparativně DNAPac RP 4 µm 2.1×50 mm (P/N 088924) a několik komerčních kol od Vendor A a B.

Hlavní výsledky a diskuse

Charakteristika stacionární fáze:

• Monodisperzní SMP částice vykazují velmi úzké rozdělení velikostí, což vede k homogennějším průtokovým cestám, menší nepravidelnosti při plnění kolony a zlepšené lot-to-lot reprodukovatelnosti oproti polydisperzním materiálům.
• Široké distribuční spektrum pórů kombinované s jednotnými částicemi umožňuje přístup velkých molekul a současně zachování kapacity a rozlišení pro malé oligonukleotidy.

Výkonnost separací:

• siRNA (21 bp): SurePac Oligo RP MDi prokázala rovnovážně lepší nebo srovnatelné tvary píků a vyšší rozlišení drobných nečistot než komparativní kolony; došlo k lepšímu oddělení antisense a sense složek a odhalení více impuritních piků.
• sgRNA (~100 nt): SurePac poskytla nejdetalizovanější profil nečistot mezi testovanými kolony, s ostřejšími vrcholy a lepším oddělením blízko elujících druhů, což je pravděpodobně důsledek přístupné pórózní struktury a odlišné selektivity.
• tRNAPHE (~25 kDa): LC–MS intact analýza pod HFIP/DBA ukázala reprodukovatelné detekce 10 intaktních molekulárních stavů nad prahovou hodnotou 5 % při jednoduše opakovaných injekcích; monoisotopická hmotnost hlavních složek měla přesnost ≤1 ppm a dominantní stav CV 0,07 ppm. Varianty lišící se o 14–16 Da byly konzistentně rozlišené.
• mRNA (1960 nt): SurePac vykázala zlepšené tvary píků a detekci počátečně elujícího vrozkazu blízko hlavního vrcholu; konkurenční kolony měly ostré přední hrany a výrazné prodlužování (tailing), což naznačuje omezený přístup do pórů a nižší kapacitu pro velké molekuly.

Reprodukovatelnost a carryover:

• Testy lot-to-lot s 8-kombo ssDNA prokázaly konzistentní retenční časy a šířky píků mezi třemi loty SurePac kolony.
• Carryover po injekci mRNA bylo nízké (~0,48 %), což je důležité pro vysokopropustné procesy a přesné stanovení nízkoúrovňových impurit.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy SurePac Oligo RP MDi platformy:

• All-in-one analytické řešení: jedna kolona pokrývá široké spektrum velikostí nukleových kyselin, redukuje potřebu více specializovaných kolon a zjednodušuje analytické workflow.
• Kompatibilita s LC–MS: vhodnost pro HFIP/DBA podmínky umožňuje detailní intact analýzy a odhalování modifikační heterogenity.
• Vysoká reprodukovatelnost: podporuje robustní vývoj metod, validaci a přenos mezi laboratořemi.
• Nízké carryover a dobrá kapacita pro velké molekuly: vhodné pro vysoce koncentrované vzorky a pro rutinní kontrolu kvality v procesu výroby terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Směřování a možnosti dalšího využití:

• Další optimalizace stacionárních fází: cílené úpravy pórózity a chemické modifikace pro ještě lepší rozlišení specifických modifikací nukleových kyselin.
• Širší integrace s vysoce výkonnými MS metrikami a softwarovými nástroji pro automatizovanou dekonvoluci a kvantifikaci modifikačních stavů.
• Rozšíření velikostí a formátů: vývoj sloupců pro preparativní či semi-preparativní separace nebo pro kontinuální analytické procesy.
• Standardizace a regulace: adopce univerzálních kolonních materiálů do regulovaných analytických protokolů u výrobců RNA terapeutik.
• Automatizace high-throughput QC: kombinace nízkého carryover a konzistence lotů dovolí rychlé validované rutinní testy v průmyslovém prostředí.

Závěr

Studie ukazuje, že monodisperzní supermakroporézní 2,5 µm SurePac Oligo RP MDi kolona představuje univerzální reverzně-fázové řešení pro komplexní charakterizaci nukleových kyselin napříč širokým rozsahem velikostí. Kolona kombinuje vysoké rozlišení, dobrou přístupnost pórů pro velké molekuly, nízké carryover a vynikající lot-to-lot reprodukovatelnost. Tyto vlastnosti zjednodušují analytické workflow, podporují LC–MS intact analýzy a mohou významně zrychlit vývoj a kontrolu kvality nukleových kyseliných terapeutik.

Reference

Ke Ma, R. Ross, S. Bechler, C. Mitter, M. De Pra, S. Lin. A novel monodisperse supermacroporous reversed-phase platform for comprehensive nucleic acid analysis across a broad size range. Thermo Fisher Scientific, poster/technical note, 2026. © 2026 Thermo Fisher Scientific Inc.