LC-UV analysis of large RNA using an inert UHPLC system

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů a velkých RNA (včetně mRNA a jejich surrogátů) je v současném farmaceutickém a biotechnologickém výzkumu kritická pro vývoj léčiv, kontrolu kvality a validaci výrobních procesů. Tyto sloučeniny jsou vysoce polární a silně aniontové, což vede k výrazným interakcím s kovovými povrchy v kapalném chromatografickém systému. Tyto interakce způsobují ztrátu signálu, rozšíření píků a sníženou kvantitativní přesnost, zejména při nižších koncentracích. Minimalizace kontaktu analytu s kovovými materiály v proudu vzorku tak výrazně zlepšuje citlivost, opakovatelnost a spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotila výkon plně inertního Vanquish Amplify UHPLC systému pro LC–UV analýzu kovově citlivých analytů (zkušební sondou byl AMPcP) a pro separaci velkých RNA fragmentů (500 a 5 000 nukleotidů). Cílem bylo porovnat citlivost, stabilitu píků a reprodukovatelnost mezi inertními komponentami (vanquish Amplify) a konvenčními biokompatibilními MP35N fluidikami, včetně srovnání s alternativním UPLC systémem s HPS povrchem (Waters Acquity Premier).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Testovací analyt: adenosine 5'-(α,β-methylene) diphosphate (AMPcP) použit jako kovově vázající model vs. adenosin jako referenční ne-vázající sloučenina.
• Koncentrace AMPcP/adenosine: 1 176 µM, 117.6 µM a 11.76 µM (ekvimolární směsi); měřeno při pH 5.2, 6.7 a 8.7 v 10 mM NH4OAc mobilní fázi.
• Velká RNA: směs 500 nt a 5 000 nt, 12 ng/µL každá komponenta; objem injekce 1 µL (24 ng celkem na kolonu); ion‑pair RP‑LC s 100 mM TEAA a 100 mM TEAA/ACN (75/25 v/v).
• Četnost: opakované injekce (až 10x pro AMPcP; 5x injekcí opakovaných 3× denně po dobu 3 dnů pro RNA) k posouzení stability a potřeby kondicionace.
• Vyplachování: použití organického TFA wash (0.1% TFA v směsi organik) a alternativně 50 mM NH4OAc pH 9.2 pro odstraňování adhezních zbytků.

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific Vanquish Amplify UHPLC se zcela inertním průtokovým kanálem od injektoru po detektor (inertní jehla, sedlo jehly, smyčka, předohřívací a kolona‑to‑detektor kapiláry, inertní semi‑micro flow cell a odpovídající Viper TQ kapiláry).
• Vanquish UHPLC s biokompatibilními MP35N fluidikami (pro porovnání se standardním nerezovým/MP35N řešením).
• Waters Acquity Premier UPLC s MaxPeak HPS technologií (cross‑vendor srovnání).
• SurePac Oligo RP MDi kolona (2.1 × 50 mm, 2.5 µm) použitá pro všechny testy pro zachování konzistence.
• Diodový pole‑detektor (DAD) při 260 nm, rychlost 20 Hz, responzní čas 0.2 s; Chromeleon 7.3.2 pro akvizici a analýzu dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukazují, že inertní průtokové cesty významně snižují ztrátu analytu způsobenou kovovými interakcemi a zlepšují analytické parametry zejména v nejnáročnějších podmínkách (nízké koncentrace a kyselé pH):

• AMPcP jako sondážní analyt: Vanquish Amplify poskytl až přibližně dvojnásobnou citlivost (zvýšení signálu) oproti systému s MP35N fluidikami při 11.76 µM a pH 5.2, tedy tam, kde jsou interakce s kovem nejsilnější. Výhoda inertního průtoku se snižovala při vyšších koncentracích a zásaditějším pH.
• Velká RNA (500 nt a 5 000 nt): první injekce na Vanquish Amplify vykázala zvýšení signálu o faktor ~1.35 (500 nt, plocha) a ~1.25 (5 000 nt, plocha) ve srovnání s MP35N systémem; zvýšení výšky píků bylo rovněž zaznamenáno (řádově 1.19–1.24× podle velikosti píků).
• Reprodukovatelnost: inertní systém poskytl konzistentnější plošné a výškové hodnoty již od první injekce, čímž odstranil nutnost předběžného kondicionování „sacrificial“ injekcemi. MP35N systém vykazoval saturaci chování a vyžadoval 2–3 injekce k dosažení stabilních hodnot.
• Cross‑vendor srovnání: Vanquish Amplify a Acquity Premier (MaxPeak HPS) vykázaly srovnatelnou výkonnost pro pozdější injekce (např. 5. injekce), což naznačuje, že plně inertní řešení Vanquish Amplify nabízí konkurenční nebo lepší citlivost zejména na počátku sekvence měření.

Interpretace: hlavním mechanizmem zlepšení je minimalizace koordinace aniontových fosfátových skupin RNA/oligonukleotidů s „tvrdými“ kationty a kovovými povrchy v průtoku. Inertní materiály a povrchové úpravy snižují adsorpci, což přímo zlepšuje plošný a výškový signál a redukuje variability při nízkých dávkách analytu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost u kovově citlivých analytů umožňuje pracovat s menšími množstvími vzorku, což je důležité u vzácných nebo drahých biologických přípravků (např. mRNA produktů).
• Eliminace nebo výrazné snížení potřeby předběžného kondicionování šetří čas a snižuje spotřebu materiálu.
• Vyšší opakovatelnost a nižší RSD píků výrazně zjednodušují kvantitativní analýzy v rámci vývoje a kontroly kvality.
• Kompatibilita s běžnými ion‑pair reagenty (TEAA) a standardními analytickými postupy umožňuje snadnou implementaci do stávajících pracovních postupů pro separaci velkých RNA.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Pokračující vývoj inertních materiálů a povrchových úprav pro další snížení nespecifických interakcí a zlepšení stability signálu, zejména při LC–MS aplikacích.
• Integrace inertních průtokových cest s vysoce citlivými hmotnostními detektory k dosažení lepšího limitu detekce a charakterizace produktů mRNA/oligonukleotidů.
• Vývoj standardizovaných wash‑protokolů a harmonizace metodik pro usnadnění přenositelnosti metod mezi laboratořemi a zařízeními různých dodavatelů.
• Minimalizace nebo náhrada ion‑pairingových reagentů vývojovými alternativami, které zachovají chromatografické rozlišení, ale zjednoduší přechod na MS‑detekci.
• Využití inertních systémů v regulovaných prostředích (QC, GLP) pro robustní monitorování kvality terapeutických oligonukleotidů a vakcín založených na mRNA.

Závěr

Plně inertní Vanquish Amplify UHPLC systém významně redukuje kovově řízené ztráty analytu u polymerních a aniontových látek jako jsou AMPcP a velké RNA. Studie prokázala až dvakrát vyšší citlivost pro kovově senzitivní analyt v nejkritičtějších podmínkách a 1.25–1.35× zvýšení signálu pro velké RNA u první injekce ve srovnání s MP35N fluidikami. Tyto vlastnosti vedou ke snížení potřeby kondicionace, úspoře vzorku a lepší opakovatelnosti — což má přímé přínosy pro vývoj i rutinní kontrolu kvality oligonukleotidových léčiv.

Reference

1. Lippard SJ, Berg JM. Principles of Bioinorganic Chemistry. University Science Books; 1994.
2. Maurer J, Malburet C, François‑Heude M, Guillarme D. Evaluation of Ion Pairing Reversed‑Phase Liquid Chromatography for the Separation of Large RNA Molecules. Journal of Chromatography A. 2024;1740:465574. doi:10.1016/j.chroma.2024.465574.
3. Sinha ND, Jung KE. Analysis and Purification of Synthetic Nucleic Acids Using HPLC. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 2015;61(1):10.5.1. doi:10.1002/0471142700.nc1005s61.