A novel monodisperse supermacroporous reversed-phase platform enabling unified LC–MS analysis of nucleic acids across a broad size range

Význam tématu

Charakterizace nukleových kyselin pomocí LC–MS je klíčová v oblasti vývoje léčiv na bázi nukleových kyselin (ASO, siRNA, mRNA, tRNA apod.). Různá délka a strukturální heterogenita analytů často vyžadují několik specializovaných separačních platforem, což zvyšuje složitost metod, náklady a riziko chyb při přenosu metodiky. Jednotná reverzně-fázová platforma schopná spolehlivě separovat a poskytovat kvalitní MS-data přes široké rozmezí velikostí by proto významně zjednodušila workflow v R&D i v režimu QA/QC.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo demonstrovat výkonnost nové monodisperzní supermakroporézní (SMP) polymerní reverzně-fázové stacionární fáze (SurePac Oligo RP MDi, 2,5 µm) jako univerzálního LC–MS řešení pro nukleové kyseliny v rozsahu od krátkých oligonukleotidů (20 nt, reprezentováno ASO Tofersenem) po delší, strukturálně heterogenní RNA (př. tRNAPhe ~75 nt). Studie hodnotila chromatografické rozlišení, MS detekci a schopnost identifikovat intact-mass a varianty analyzovaných vzorků.

Použitá metodika

Pracovní přístup kombinoval reverzně-fázové ion-pair LC s MS-kompatibilními pufry (HFIP/DBA) a vysokorozlišeným Orbitrapovým hmotnostním spektrometrem. Pro ASO byla použita velmi rychlá metoda (5 min), pro tRNA prodloužený gradient (do 15 min) optimalizovaný pro rozlišení variant. Klíčové podmínky zahrnovaly mobilní fáze s 15 mM dibutylaminu (DBA) a 20 mM HFIP na pH ~9 ve vodné fázi a acetonitril jako organickou fázi, průtok 25 µL/min, teplota kolony 50 °C a injekční objemy 1 µL (koncentrace: ASO 1 µg/µL, tRNA 400 µg/µL). MS akvizice probíhala v negativním ionizačním módu s vysokým rozlišením (240 000), širokým m/z rozsahem vhodným pro více-nabité obálky nukleových kyselin a dekonvolučním zpracováním pro získání neutrálních intact-mass hodnot.

Použitá instrumentace

- Kolona: Thermo Scientific SurePac Oligo RP MDi, 2,5 µm, 0,3 × 50 mm.
- UHPLC systémy: Thermo Scientific Vanquish Horizon pro LC–UV; Vanquish Neo pro LC–MS.
- Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Ascend Tribrid (akvizice v negativním módu, vysoké rozlišení 240 000).
- Software a kalibrace: Xcalibur pro řízení MS, Freestyle a BioPharma Finder pro analýzu dat; kalibrace prováděna FlexMix roztokem.
- Klíčové MS parametry: negativní ionizace, AGC target ~4e5, ion transfer tube ~300–350 °C, vaporizer 75–320 °C (podle analyzovaného vzorku).

Hlavní výsledky a diskuse

- Monodisperzní částice SMP vykazují velmi úzké rozdělení velikostí ve srovnání s konvenčními polydisperzními materiály, což přináší lepší opakovatelnost výroby kolony a menší lot-to-lot variabilitu. SEM snímky ukázaly jednotnou morfologii částic s konzistentními rozměry.

- ASO (Tofersen, 20 nt): Kolona poskytla rychlou a ostrou chromatografickou píku (hlavní pik ~1,65 min v 5min metodě). MS přineslo dobře definovanou více-nabitou obálku; dekonvoluce potvrdila intact-mass 7123,170 Da. Byla detekována minoritní forma odpovídající DBA aduktu (~7252,322 Da), což ukazuje citlivost metody k aduktům z ion-pair činidel.

- tRNAPhe (~75 nt): SurePac kolona umožnila separaci větších, strukturálně heterogenních RNA s třemi hlavními chromatografickými funkcemi ~9,2; 9,6; 9,9 min. Dekonvoluce identifikovala dominantní intact-mass 24610,450 Da (hlavní tRNA), demethylovanou variantu 24596,437 Da a minoritní sekvenční variantu 24625,454 Da (souhlasná s A/U → G/C záměnou). To dokládá schopnost platformy rozlišit posttranslační modifikace a sekvenční varianty u intaktních RNA.

- Interpretace: Kombinace vysoké účinnosti separace (díky monodisperznímu SMP materiálu), MS-kompatibilního ion-pair mobile-phase a vysokého rozlišení Orbitrapu umožnila spolehlivou intact-mass charakterizaci napříč širokým rozsahem hmotností. Detekce DBA aduktů zároveň upozorňuje na potřebu optimalizace postupů snižování aduktace při práci s ion-pair činidly.

Přínosy a praktické využití metody

- Jednotná kolona pokrývá analýzu od krátkých oligonukleotidů po středně dlouhé RNA, což snižuje nutnost držet více separačních platforem.
- Vysoká reprodukovatelnost a robustnost usnadňují přenos metod mezi laboratořemi a podporují rutinní nasazení v QC/QA a vývoji léků.
- Rychlé metody pro ASO umožňují vysokou průchodnost (throughput) při zachování schopnosti potvrdit intact-mass; prodloužené gradienty zase umožňují detekci variant u delších RNA.
- MS-kompatibilní ion-pairing (HFIP/DBA) poskytuje dobrý kompromis mezi chromatografií a citlivostí MS při práci s nukleovými kyselinami.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Rozšíření aplikace na ještě delší a komplexnější mRNA konstrukty a modifikované nukleové kyseliny (chemické modifikace, konjugáty).
- Kombinace s top-down nebo middle-down sekvenováním a s automatizovanými dekonvolučními nástroji pro detailnější mapování modifikací a variant.
- Optimalizace mobilních fází a strategií pro eliminaci aduktů (alternativní ion-pair činidla, post-column či off-line desalting) za účelem zlepšení přesnosti intact-mass měření.
- Standardizace a validace metod pro regulační účely v rámci QC pro farmaceutické produkty založené na nukleových kyselinách.
- Vývoj obdobných monodisperzních materiálů se zaměřením na vyšší kapacitu, delší životnost a kompatibilitu s širším spektrem pufrů.

Závěr

Studie ukazuje, že monodisperzní supermakroporézní SurePac Oligo RP MDi kolona představuje schopnou univerzální reverzně-fázovou platformu pro LC–MS analýzu nukleových kyselin v rozsahu ~20–75 nt. Platforma kombinuje vysoké chromatografické rozlišení, dobrou reprodukovatelnost a kompatibilitu s vysokorozlišeným Orbitrap MS pro intact-mass potvrzení a detekci variant, čímž snižuje potřebu použití více separačních systémů a usnadňuje analytické workflow.

Reference

Ma K, Ross R, Bechler S, Mitter C, De Pra M, Lin S. A novel monodisperse supermacroporous reversed-phase platform enabling unified LC–MS analysis of nucleic acids across a broad size range. Thermo Fisher Scientific; 2026. PO004703-2026-EN.