Polymeric, porous, monodisperse particle development and application to reversed-phase separations of biological molecules

Význam tématu

Vývoj monodisperzních, supermakroporézních polymerních částic je důležitý pro reverzní-fázové separace biologických makromolekul, zejména polynukleotidů a větších biopolyměrů (siRNA, sgRNA, mRNA, dlouhá dsDNA). Přesná kontrola velikosti částic a porézní struktury umožňuje optimalizovat přístupnost povrchu, hromadný přenos a retenci analyzovaných molekul, což je klíčové pro vysokorychlostní chromatografii v analytickém i QC prostředí, včetně aplikací kompatibilních s hmotnostní spektrometrií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a charakterizovat monodisperzní supermakroporézní (SMP) polymerní částice vhodné pro reverzní-fázovou separaci širokého spektra polynukleotidů a vyhodnotit vliv porozity (povrchová plocha vs. průměr pórů) a inkorporace aminoskupin jako kopolymeru na retenci a rozlišení. Práce porovnává nové monodisperzní částice (~2.5 µm) s tradičními polydisperzními částicemi ~4 µm a ukazuje chromatografické výsledky pro ssDNA, dsDNA, siRNA, sgRNA a mRNA.

Použitá metodika a instrumentace

Výroba částic: emulzní polymerace monomeru, crosslinkeru a porogenu pro dosažení přesné velikosti a nízké disperze velikostí; modifikace fáze pomocí nízkého procenta terc. aminoskupin jako kopolymeru pro zavedení pozit. náboje.

Charakterizace fyzikálních parametrů částic a chromatografie:

• Velikost částic: Beckman Coulter Multisizer 3 (Coulter Counter).
• Povrchová plocha a porozita: Micromeritics ASAP (BET, BJH).
• SEM: Phenom ProX pro morfologii porézní struktury.
• Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish H systém se software Chromeleon 7.2.10; kolony 2.1×50 mm plněné prototypovými SMP částicemi.
• Mobilní fáze: 0.1 M TEAA nebo 0.1 M amonný acetát s acetonitrilem (gradienty uváděny v pracovních příkladech); některé běhy bez ion-pairing činidel (IP-free) pro LC–MS kompatibilitu.
• Detekce: UV při 260 nm; teploty 50–60 °C; průtoky typicky 0.4 mL/min; injekce 2 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

- Monodisperzní částice ~2.5 µm nemají „fines“ (<1 µm) typické pro polydisperzní 4 µm prachy, což umožňuje použití malých průměrů částic bez dramatického zvýšení tlaku.

- Vzájemná závislost povrchové plochy a průměrné velikosti pórů: vyšší povrchová plocha koresponduje s menšími póry a menším BJH objemem; menší povrchová plocha odpovídá větším pórům a otevřenější struktuře povrchu.

- Vliv porozity na separaci polynukleotidů:

• Pro krátké ssDNA (12–40 mer) je pozorován pokles retenčního času s klesající povrchovou plochou (větší póry → méně celkové plochy adsorpce pro malé fragmenty).
• U dsDNA obsahující krátké i dlouhé fragmenty (72–1353 bp) klesá retence krátkých fragmentů s klesající plochou, avšak u nejdelších fragmentů se retence zvyšuje při klesající ploše (větší póry). To je interpretováno tak, že větší póry a otevřenější struktura zajišťují lepší přístupnost povrchu pro objemné polynukleotidy a tím zlepšenou interakci a separaci dlouhých fragmentů.
• SMP částice tak prokazují schopnost pokrýt široké molekulové hmotnostní spektrum: selektivita závisí na kompromisu mezi celkovou plochou (pro malé fragmenty) a velikostí pórů/volnou strukturou (pro velké fragmenty).

- Vliv aminoskupin (terciární aminové kopolymery): přidání 0.15–1.5 % amine comonomeru zvyšuje retenční čas anionických oligonukleotidů, přičemž 0.5 % aminu vykazuje zlepšené rozlišení při mobilních fázích bez ion-pairingu (IP-free), což podporuje použití v LC–MS kompatibilních protokolech.

- Chromatogramy pro siRNA, sgRNA a mRNA ukazují, že 2.5 µm SMP s ~18 m2/g (větší póry) dokážou oddělit krátké i dlouhé polynukleotidy s vhodnou volbou povrchové chemie a mobilní fáze.

Přínosy a praktické využití metody

- Vyšší reálná přístupnost povrchu pro makromolekuly: SMP částice umožňují lepší separace velkých oligonukleotidů a mRNA než konvenční vysoce plošné, malopórové materiály.
- Malé monodisperzní částice bez fines snižují riziko zvýšení tlaku a zlepšují reprodukovatelnost při použití sloupků s malým vnitřním průměrem.
- Možnost aplikace v analytickém a QC prostředí pro biologickou léčbu a vakcíny (mRNA, siRNA), včetně postupů kompatibilních s hmotnostní spektrometrií díky redukci/nepotřebnosti ion-pairing činidel při použití aminoskupin na fázi.
- Flexibilita: optimalizací poměru porosity/surface area a míry funkčních kopolymerů lze přizpůsobit fázové vlastnosti pro různé délky a typy polynukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace porozní architektury (kontrola tvaru pórů, distribučního spektra pórů) pro rozšíření rozsahu separace a zlepšení rychlosti hromadné výměny.
• Rozšíření povrchových chemických modifikací: další ionické nebo polární kopolymery (kationické/anionické) a kombinované ligandní funkce pro jemné ladění selektivity.
• Kombinace s LC–MS: vylepšení mobilních fází a povrchové chemie směřující k plně kompatibilním protokolům bez ion-pairing činidel pro citlivou hmotnostní spektrometrii polynukleotidů a produktů mRNA.
• Scale-up a přizpůsobení pro průmyslový QC, vysokopropustné screeningové platformy a kontinuální výrobní linky v biotechnologii.
• Aplikace i pro proteinové separace a multimodální fázové systémy, kde velké póry a kontrolovaná chemie mohou zlepšit obnovitelnost a rozlišení.

Závěr

Monodisperzní supermakroporézní polymerní částice vyrobené emulzní polymerací představují slibný materiál pro reverzní-fázové separace polynukleotidů napříč širokým rozsahem molekulových hmotností. Klíčovým parametrem je správná volba porozity (povrchová plocha vs. průměr pórů) pro cílové molekuly: menší póry a větší plocha favorizují separaci krátkých fragmentů, zatímco větší póry zlepšují přístupnost a retenci dlouhých polynukleotidů. Zavedení nízkého podílu aminoskupin umožňuje zvýšení retence anionických oligonukleotidů a zlepšení separace v mobilních fázích kompatibilních s MS bez nutnosti ion-pairing činidel. Technologie má přímé využití v analytice a kontrole kvality moderních nukleových kyselinových terapií a nabízí jasné směry pro další vývoj.

Reference

Souhrn použitých přístrojů a zdrojů materiálů uvedených ve studii:

• Chromatografický systém: Thermo Scientific Vanquish H; software Chromeleon 7.2.10.
• Velikost částic: Beckman Coulter Multisizer 3 (Coulter Counter).
• Plocha/porozita: Micromeritics ASAP (BET, BJH).
• SEM: Phenom ProX.
• Vzorky a spotřební materiál: dsDNA marker ΦX174/BsuRI (Thermo Fisher), MISSION® siRNA (Millipore Sigma), sgRNA (Integrated DNA Technologies); mRNA transkript syntetizován in-house (Thermo Fisher Scientific).