Confident intact mass analysis of the tRNA isodecoders of phenylalanine by UHPLC-HRAM-MS and BioPharma Finder software

Význam tématu

Analýza intaktní hmotnosti transferové RNA (tRNA) je klíčová pro pochopení posttranskripčních modifikací, které ovlivňují stabilitu, čtení kodonů a interakce RNA s proteiny. Tradiční přístup založený na enzymatické digesci vede ke komplexnímu spektru fragmentů, zatímco intaktní analýza umožňuje rychlé a přímé stanovení celkové sekvence spolu s modifikacemi.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo prokázat schopnost detekce a identifikace izodekoderů tRNA pro fenylalanin (tRNAPHE) pomocí ultravysoce výkonné kapalinové chromatografie s iontově párovou reverzní fází a vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie. Studie ukazuje identifikaci hlavních variant A67 a minoritní G67 včetně jejich truncací na 3 konci a modifikačních stavů.

Použitá metodika

Metoda vychází ze spojení iontově párové reverzní fáze s dibutylaminem a polymerové kolony DNAPac RP. Mobilní fáze obsahovala hexafluorpropanol a acetonitril. Rozdělovací gradient umožnil separaci intaktních tRNA až do plného baseline rozlišení izotopových vzorů. Na straně hmotnostního spektrometru byl použit režim negat. ionizace s rozsahem m/z 800–3000 a rozlišením 240 000. Pro dekonvoluci spekter a výpočet monoisotopických hmotností byl využit algoritmus Xtract v rámci softwaru BioPharma Finder.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie Vanquish Horizon UHPLC se základnou System Base F/H, Binary Pump H, Split Sampler HT a Column Compartment H
• Iontově párová kolona DNAPac RP (4 μm, 2,1 × 100 mm)
• Hmotnostní spektrometr Orbitrap Ascend Tribrid s iontovým zdrojem OptaMax NG
• Software Xcalibur, Freestyle a BioPharma Finder
• Vakuuový koncentrátor Savant SpeedVac DNA 130
• Spektrofotometr NanoDrop One/OneC

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní hmotnostní spektra ukázala nabíjecí obálku tRNAPHE od –9 do –26 se špičkami nejvyšší relativity v oblasti –15 až –19. Dekonvoluce odhalila hlavní vrchol s monoisotopickou hmotností 24 610,532 Da odpovídající A67 variantě s truncací CpC a 5 fosfátem. Minoritní G67 varianta byla detekována s posunem +15 Da a relativní abundancí 25,8 %. Nečekaný vrchol –13,9 Da pod hlavním signálem korespondoval s demethylovaným yW nucleosidem. U všech identifikovaných druhů byla dosažena hmotnostní přesnost pod 5 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

• Senzitivní a spolehlivá detekce intaktních tRNA i v nízkých abundancích
• Minimální addukce sodíku díky iontově párové chromatografii s dibutylaminem
• Rychlá práce bez nutnosti enzymatické digesce nebo složité přípravy vzorku
• Flexibilní workflow softwaru BioPharma Finder pro tvorbu vlastních modifikací a automatizovanou dekonvoluci

Budoucí trendy a možnosti využití

Propojování intaktní hmotnostní analýzy s dalšími transkriptomickými přístupy umožní širší mapování RNA modifikací v různých biologických systémech. Vylepšení rychlosti vyhodnocení a automatizace předzpracování vzorků povede k vysokopropustným aplikacím ve výzkumu i kvalitativní kontrole biopharma produktů. Vývoj nových softwarových modulů pro komplexní analýzu heterogenních RNA směsí rozšíří využití metody na velké RNA a ribozomy.

Závěr

Popsaná metoda spojuje výhody ultra vysokého rozlišení hmotnostní spektrometrie a iontově párové chromatografie pro rychlou a přesnou analýzu intaktních tRNA. Díky softwaru BioPharma Finder lze snadno parametrizovat sekvence, modifikace a dekonvoluci spekter. Výsledný protokol umožňuje přesnou detekci sekvenčních variant, truncací i modifikačních odlišností s vysokou spolehlivostí.

Reference

1. Boccaletto P et al MODOMICS databáze RNA modifikací 2017 update Nucleic Acids Res 2018 46 D303–D307
2. Keith G Dirheimer G Evidence minor variant tRNA Phe in yeast Biochem Biophys Res Commun 1987 142 183–187
3. Vanhinsbergh CJ et al Characterization large RNA mass spectrometry Anal Chem 2022 94 7339–7349
4. Ross RL et al mRNA 5 capping UHPLC-HRAM-MS BioPharma Finder Application Note 001108 Thermo Fisher Scientific
5. Kebarle P Tang L From ions in solution to gas phase mechanism of electrospray Anal Chem 1993 65 972A–986A
6. Kebarle P Verkerk UH Electrospray ionization fundamentals Mass Spectrom Rev 2009 28 898–917
7. Apffel A et al Analysis oligonucleotides HPLC electrospray mass spectrometry Anal Chem 1997 69 1320–1325
8. Jarrous N Reiner R Human RNase P tRNA processing enzyme transcription factor Nucleic Acids Res 2007 35 3519–3524
9. RajBhandary U et al Primary structure yeast phenylalanine tRNA Proc Natl Acad Sci 1967 57 751–758
10. Huang TY Liu J McLuckey SA Top down tandem mass spectrometry of tRNA J Am Soc Mass Spectrom 2010 21 890–898
11. Noma A et al Biosynthesis of wybutosine a hypermodified nucleoside in eukaryotic phenylalanine tRNA EMBO J 2006 25 2142–2154