LC-MS analysis of intact and subunit-level mAb enabled by a novel monodisperse supermacroporous reversed-phase platform

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou složité biologické léčiva s širokým spektrem post-translačních modifikací a proteoform. Spolehlivá a rychlá charakterizace jak intactních molekul, tak jejich subjednotek, je klíčová pro kontrolu kvality, bezpečnost a účinnost produktu. LC–MS zůstává preferovanou technikou pro stanovení molekulární hmotnosti, heterogenity a identifikaci variant, avšak praktické workflow často vyžaduje více chromatografických sloupců optimalizovaných pro různé velikosti analyzátů. Unified přístup, který umožní separaci intactních mAb i jejich subjednotek na jednom RP sloupci za MS-kompatibilních podmínek, má proto značnou praktickou hodnotu pro R&D i QC laboratoře.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkonnost nového monodisperzního supermakroporózního (SMP) polymerního RP materiálu (SurePac Protein RP MDi, 2.5 µm) pro jednotné LC–MS stanovení intactních mAb a subjednotek (redukce DTT, IdeS digesce). Autoři demonstrovali, že s tímto sloupcem je možné dosáhnout baseline separace intactního mAb, lehkého (LC) a těžkého (HC) řetězce, scFc a F(ab′)2 v rámci krátkého (~10 min) gradientu a získat přesné hmotnosti pro hlavní proteoformy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorek: NISTmAb (referenční mAb).
• Redukce: DTT 20 mM, inkubace při 37 °C a 300 rpm po dobu 30 min (pro generování LC a HC).
• IdeS digesce: poměr enzymu 1 U/1 µg mAb, inkubace při 37 °C a 300 rpm po dobu 30 min (pro scFc a F(ab′)2).
• Eluce: reverzní fáze s kyselinou formiovou (0,1 %) v mobilních fázích; gradientní separace navržená pro rychlý rozběh a návrat do výchozí složení během ~10–18 min v závislosti na režimu (intact vs. subunit).

Instrumentace:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon.
• Sloupec: Thermo Scientific SurePac Protein RP MDi, formát 2.1 × 50 mm.
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 s OptaMax NG ion source, HESI zdroj v módu pozitivní ionizace pro proteiny.
• Software: Xcalibur pro řízení a sběr dat; Thermo Freestyle a BioPharma Finder (algoritmy Xtract a ReSpect) pro dekonvoluci a určení aduktových hmotností.
• Provozní podmínky: průtok 0.4 mL/min, teplota kolony a předehřívače 80 °C, injekční objem 0.25–0.5 µL; MS nastavení zahrnovala dvousegmentové full MS skenování s upravitelnými m/z rozsahy a vysokým rozlišením (až 240 000) pro některé režimy.
• Reagencie: IdeS (Promega), DTT (Thermo Fisher Scientific), rozpouštědla LC–MS třídy (Fisher Scientific), NISTmAb (Sigma-Aldrich).

Hlavní výsledky a diskuse

Studie prokázala, že SurePac Protein RP MDi dosahuje efektivní a rychlé separace intactního mAb i subjednotek během 10minutového gradientu za MS-kompatibilních podmínek. Klíčové body výsledků:

• Baseline separace intactního mAb, LC, HC, scFc a F(ab′)2 v krátkém časovém okně umožnila sběr kvalitních spekter pro následnou dekonvoluci.
• Přesné (v rámci několika ppm) a opakovatelné určování průměrných a monoisotopických hmotností hlavních proteoform bylo možné díky vysokému rozlišení Orbitrapu a vhodným MS nastavením.
• Identifikované dominantní modifikace zahrnovaly C-terminální odštěpení lyzinu a N-terminální přeměnu na pyroglutamát na HC; u scFc byly přiřazeny běžné glykoforomace (A2G0F, A2G1F, A2G2F) na základě shody hmotnosti — tyto přiřazení jsou považovány za putativní, dokud nejsou potvrzeny orthogonálními technikami (např. LC–MS/MS).
• Na intactní úrovni byla chromatografická separace méně rozlišující vzhledem k vysoké heterogenitě, avšak poskytla dostatečné rozlišení pro získání kvalitních celkových hmotností a pro rychlou kontrolu proteoformního profilu.
• Monodisperzní částice a supermakroporózní struktura matrice přispívají k dobrému přístupu masivních proteinů k povrchu a zároveň zachovávají kapacitu pro menší subjednotky, čímž eliminují nutnost výměny sloupce mezi workflow pro různé velikosti analyzátů.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy vyplývají z možnosti sjednotit několik analytických typů do jednoho, rychlého, MS-kompatibilního workflow:

• Zvýšení průchodnosti analýz (short-run 10 min) pro screening a rutinní kontroly.
• Snížení potřeby více specializovaných sloupců a zjednodušení metodologie v laboratořích R&D i QC.
• Možnost rychlé identifikace hlavních proteoform a odhad glykanového profilu na subjednotkové úrovni bez časově náročného peptide mappingu.
• Vysoká kvalita spekter vhodná pro dekonvoluci a přesné určování hmotnosti, podporující formulaci, stabilitní studie a kontrolu výrobních šarží.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciální směry rozvoje a implementace této techniky zahrnují:

• Integraci s LC–MS/MS (HRAM MS/MS) pro potvrzení post-translačních modifikací a sekvenční identifikaci proteoform.
• Validace a robustnostní studie v rámci QC/komerčních laboratoří pro nasazení jako rutinní multi-purpose sloupcové řešení.
• Rozšíření použití na další biotechnologické produkty (fragmenty, konjugáty, bispecifické protilátky) a adaptace gradientů pro zlepšení rozlišení specifických variant.
• Automatizace workflow včetně online digesce nebo automatizované přípravy subjednotek pro zvýšení throughputu.
• Využití v rámci multi-attribute metod (MAM) pro kvantitativní sledování kritických kvalitatních atributů.

Závěr

Studie demonstruje, že použití monodisperzního supermakroporózního RP materiálu SurePac Protein RP MDi umožňuje rychlý, MS-kompatibilní a jediným sloupcem provedený protokol pro separaci intactních mAb i jejich subjednotek. Metoda přináší dobrý kompromis mezi rychlostí a analytickou informativností, s dostatečnou přesností hmotnostního určení pro identifikaci hlavních proteoform a predikci glykanových variant. Tento přístup může významně zjednodušit rutinní charakterizaci mAb v laboratorních provozech.

Reference

1. Žvirblis A., Dembovskytė O., Ma K., Mitterer C., De Pra M., Steiner F. LC–MS analysis of intact and subunit-level mAb enabled by a novel monodisperse supermacroporous reversed-phase platform. Thermo Fisher Scientific application note PO004763 EN 0626 (2026).
2. Produktové a materiálové odkazy: SurePac Protein RP MDi (Thermo Fisher Scientific); NISTmAb (Sigma-Aldrich); IdeS (Promega); DTT (Thermo Fisher Scientific).