Cation exchange coupled to high resolution mass spectrometry for the analytical characterization of phosphorodiamidate morpholino oligomers

Význam tématu

Phosphorodiamidate morpholino oligomers (PMO) představují rostoucí třídu syntetických oligonukleotidů s unikátními chemickými vazbami, které odstraňují záporný náboj obvyklého fosfátového páteřního řetězce. Tato modifikace zvyšuje stabilitu a farmakologické vlastnosti, ale současně činí tradiční analytické přístupy pro identifikaci a kvantifikaci nečistot neúčinnými. Vývoj robustních, citlivých a GLP-kompatibilních analytických metod pro komplexní charakterizaci PMO je klíčový pro vývoj a kontrolu jakosti RNA terapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a demonstrovat novou přímou analytickou workflow pro separaci a identifikaci PMO a jejich nečistot použitím kationtové výměnné chromatografie (CX) přímo spojené s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií (HRMS). Studie ověřila schopnost metody separovat a kvantifikovat široké spektrum modifikací a degradantů (např. amidace, deaminace, oxidace, ztráty bází, N-1/N+1 produkty, alkylace, tail-off), a to pro čtyři farmaceuticky relevantní PMO standardy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika je založena na kationtové výměnné chromatografii s pH gradientem vynuceným těkavými eluenty tak, aby jednotlivé složky eluovaly při svém isoelektrickém bodě. Eluát je detekován v pozitivním ionizačním režimu pomocí HRMS. Klíčové prvky instrumentace a softwaru:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex Binary UHPLC.
• Kolona: Thermo Scientific ProPac 3R (3 µm, 2.1 × 50 mm) pro kationtovou výměnu.
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris (HRMS), rozlišení 120 000 pro anotované spektra.
• Řízení a zpracování dat: Chromeleon 7.4 nebo 7.3.2; sliding windows deconvolution; CM reporting engine 2.0; interní přenos dekonvoluovaných komponent do tabulky XIC pro kvantifikaci.
• Vzorky: čtyři komerčně dostupné PMO standardy – Golodirsen, Casimersen, Vitolarsen a Eteplirsen.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala, že kationtová výměna s těkavým pH gradientem umožňuje selektivní retenci a chromatografické rozlišení PMO a jejich nečistot na základě isoelektrického bodu, sekvenční selektivity i velikosti. Klíčové poznatky:

• Optimalizace zdrojových podmínek: in-source kolizní energie byla nastavena na 30 eV, což minimalizuje artefaktovou fragmentaci a zároveň redukuje addukty. Vyšší energie (50–70 eV) vedly k nežádoucí ztrátě bází a výrazné fragmentaci u některých PMO.
• Separační výkon: amidátové modifikace a deaminace jsou chromatograficky separované, což umožňuje jejich samostatné kvantifikování.
• Identifikace: použití dekonvoluovaných intaktních hmotností a porovnání delta-masy vůči plné délce produktu (FLP) společně s retenčními časy poskytlo vysokou jistotu identifikace nečistot.
• Kvantifikace: kombinace dekonvoluce a cílených XIC analýz umožnila jak cílenou, tak neřízenou analýzu; limity detekce byly pod 0,02 % frakčního zastoupení.
• Reprodukovatelnost: na příkladu Casimersenu byl FLP ~62,9 % a nízká úroveň deaminace ~0,46 % s RSD 2,8 % pro nejnižší sledovaný komponent — vynikající přesnost pro tento typ analytiky.
• Spektrální kvalita: vysoké rozlišení (120 000) poskytlo čisté izotopické profily pro jednotlivé separované komponenty, což zlepšilo anotaci a jistotu přiřazení modifikací.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutý workflow poskytuje praktickou a přenosnou platformu pro rutinní kontrolu kvality a charakterizaci PMO:

• Univerzálnost: stejné chromatografické a MS parametry fungovaly pro všechny čtyři testované PMO, což naznačuje možnost platformního použití pro další kandidáty.
• Senzitivita a přesnost: velmi nízké LOD a nízké RSD umožňují detekci stopových nečistot a robustní kvantifikaci degradantů.
• GLP-kompatibilita: metoda je realizovatelná v souladu s GLP při použití Chromeleon softwaru pro automatizované reportování, dekonvoluovaná spektra a XIC tabulky.
• Ekologie: použitý těkavý eluční systém je popisován jako šetrný k životnímu prostředí ve srovnání s tradičními nevolatilními sloučeninami pro iontovou výměnu.
• Specifické výstupy: přímé stanovení deaminace v PMO, poprvé popsáno u oligonukleotidů použitím přímého spojení CX–HRMS.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda otevírá několik směrů pro další rozvoj a aplikace:

• Rozšíření na rutinní QC: zavedení do regulovaných laboratoří pro stabilitní studie a výrobní kontrolu PMO kandidátů.
• Adaptace na nižší rozlišení MS: workflow lze modifikovat tak, aby fungoval i s nízkorozlišovacími instrumenty pro širší dostupnost v rutinních laboratořích.
• Kompozitní separace: integrace s 2D-LC (např. kombinace ion-exchange a reverzní fáze) pro ještě hlubší rozlišení komplexních nečistot.
• Automatizace a softwarový rozvoj: pokročilejší algoritmy dekonvoluce, automatická anotace modifikací a validované reportovací šablony usnadní standardizaci.
• Regulační přijetí: systematická validační data a mezi-laboratorní studie podpoří akceptaci metody regulačními subjekty pro analýzu PMO.
• Aplikace na jiné neionizované oligonukleotidy: princip pH řízené kationtové výměny lze zkoušet i u dalších modifikovaných oligonukleotidů bez záporného náboje.

Závěr

Studie představuje první komplexní a přímý CX–HRMS workflow pro analýzu PMO, které kombinuje pH gradientní kationtovou výměnu s pozitivním režimem HRMS, sliding windows dekonvolucí a cílenou XIC kvantifikací. Metoda nabízí vysokou senzitivitu, reprodukovatelnost a schopnost chromatograficky oddělit a kvantifikovat kritické modifikace, včetně deaminace. Díky jednotným parametrům pro různá PMO a GLP-kompatibilnímu zpracování dat představuje robustní platformu pro vývojové a výrobní analytiky zaměřené na nové oligonukleotidové terapie.

Reference

1. Wei T., Wang M., Cai B.Z. Development of a two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry workflow for characterization of phosphorodiamidate morpholino oligomers. Journal of Chromatography A, 2025, 1757, 466129.