Green ion pair and HFIP free method for ASO RNA analysis with GLP compliant automated data handling

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie, zejména antisense oligonukleotidy (ASO) a terapeutické RNA, se rychle rozvíjejí a nabízejí cílené přístupy k léčbě řady onemocnění. Úspěšná aplikace těchto vysoce modifikovaných molekul závisí na přesném charakterizování jejich čistoty, stability a profilů impurit. Klasické metody založené na HFIP a iontovém párování jsou často náročné, zatěžují zdroje a nemusí splňovat přísné požadavky GLP.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce je prezentovat robustní a plně GLP kompatibilní workflow pro analýzu ASO na úrovni intaktních molekul, bez použití HFIP a aminových iontových párů. Studie demonstruje postup na modelovém ASO Nusinersenu, kombinuje reverzní fázi při vysokém pH, vysokorozlišovací Orbitrap Exploris MS a automatizované zpracování v Chromeleon software.

Použitá metodika a instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex Binary s DNAPac RP kolonkou (4 μm, 2.1×100 mm).
• Eluční systém: vodná fáze s 10–20 mM acetátem amonným, gradient pro efektivní separaci při vysokém pH.
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris s optimalizovanými jemnými zdroji pro minimalizaci in-source aduktů a fragmentace.
• Software: Chromeleon 7.3.2 s reporting engine 2.0, automatickou dekonvolucí spekter, XIC analýzou a GLP validovaným workflow.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace podmínek zdroje umožnila odstranění aduktů při zachování nízké tvorby in-source fragmentů. Analýza Nusinersenu prokázala stabilitu molekuly až do energie srážek 70 eV, přičemž byly identifikovány pouze reálné impurity. Porovnání dekonvoluce a cílené XIC kvantifikace ukázalo srovnatelné výsledky, což poskytuje dodatečnou důvěru v kvantitativní výstupy. Workflow zvládá automatický přenos identifikovaných komponent do XIC tabulky a volbu vhodných nabitých stavů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou a robustní analýzu čistoty ASO bez potřeby složitého přípravného činidla HFIP či iontových párů. Plná automatizace v Chromeleonu zjednodušuje přechod k GLP prostředí, zkracuje dobu analýzy v QA/QC procesech a usnadňuje sledování impurit v průmyslovém měřítku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření této metodiky na další modifikované oligonukleotidy a kombinace s triple kvadrupólovými MS systémy pro dosažení ještě vyšší citlivosti a specificity. Dále lze integrovat online validaci i pokročilé algoritmy pro predikci degradace a automatické vyhodnocování spekter.

Závěr

Prezentovaný HFIP- a iontově párovací činidla nepotřebující RP-LC-HRMS workflow s Orbitrap Exploris a Chromeleon softwarem poskytuje spolehlivou, citlivou a plně GLP kompatibilní metodu pro charakterizaci čistoty a impurit ASO. Metoda je vhodná pro farmaceutický vývoj i rutinní QC v laboratořích.