Capillary flow ion pair reversed-phase separation for very sensitive oligonucleotide LC-HRMS analysis and characterisation

Význam tématu

Ion-pair reversed-phase kapilární LC-HRMS analýza oligonukleotidů představuje klíčový nástroj pro charakterizaci terapeutických RNA a DNA molekul. Rostoucí poptávka po mRNA vakcínách a antisense terapiích vyžaduje vysoce citlivé, šetrné a efektivní metody s minimální spotřebou vzorku a elučního mobilního fáze.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je zavedení workflow pro ion-pair reversed-phase chromatografii při kapilárních průtocích (2–5 µl/min) kombinané s vysokorozlišujícím Orbitrap MS pro analýzu oligonukleotidů o délce 10–55 basických párů. Metoda s využitím DNAPac RP kapilární kolony a Vanquish Neo UHPLC má zajistit vysokou citlivost a rozlišení při minimální spotřebě eluentu a vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolona: Thermo Scientific DNAPac RP 300 µm ID, 50 mm délka
• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo s kapilárním průtokem 2–5 µl/min
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 s EASY-Spray nízkoprůtokovým zdrojem
• Eluční systémy: A – 20 mM triethylamin (TEA) a 60 mM HFIP ve vodě; B – stejné složení v methanolu
• Gradient: lineární 5–90 % B za 4–7 min při 4 µl/min
• Software: Chromeleon CDS v7.3.2; BioPharma Finder v5.2 pro dekonvoluci

Hlavní výsledky a diskuse

• Baseline separace směsi 10–55 mer oligonukleotidů v 4min gradientu při 4 µl/min
• Účinné oddělení duplexu sense/antisense během 7 min
• Čistá MS spektra bez detekovatelných Na/K aduktů a bez in-source fragmentace
• Snížení spotřeby eluční fáze a vzorku až o 100× oproti standardním mikročasovým metodám
• Intakt dekonvoluce s isotopickým sliding window poskytuje retenční časy a potvrzení identity FLP a nečistot N-1/N+1

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazně vyšší citlivost a nižší mez detekce oproti mikročasovým IP-RP metodám
• Významné omezení spotřeby vzorku – vhodné pro cenné mRNA a ASO přípravky
• Snadná integrace do rutinní QA/QC biopharma laboratoře
• Rychlý přechod od výzkumu k validovaným workflow s minimálními úpravami

Budoucí trendy a možnosti využití

Využití kapilární IP-RP LC-HRMS se dá dále rozšířit na sekvenování dlouhých mRNA fragmentů, detekci posttranslačních modifikací a integraci do plně automatizovaných on-line workflow. Další vývoj zahrnuje adaptaci pro nanoprůtokové systémy a aplikaci na komplexní biologické matice.

Závěr

Představená kapilární IP-RP LC-HRMS metoda poskytuje rychlou, citlivou a vysoce selektivní analýzu oligonukleotidů s výrazným snížením spotřeby vzorku a eluční fáze. Díky čistým spektrům bez kovových aduktů a automatizované dekonvoluci představuje vhodné řešení pro výzkum i rutinní kontrolu kvality terapeutických oligonukleotidů.

Reference

• Vanhinsbergh C.J., Criscuolo A., Sutton J.N., Murphy K., Williamson A.J.K., Cook K., Dickman M.J. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 2022, 94, 7339–7349.
• Rentel C., Gaus H., Bradley K., Luu N., Kolkey K., Mai B., Madsen M., Pearce M., Bock B., Capaldi D. Assay, Purity, and Impurity Profile of Phosphorothioate Oligonucleotide Therapeutics by Ion Pair–HPLC–MS. Nucleic Acid Therapeutics. 2022, 32(3), 206–220.