Complementary LC/MS and UV‑Vis Spectrophotometry for siRNA Quality Control and Thermal Stability Assessment

Význam tématu

Malé interferenční RNA (siRNA) jsou rychle se rozvíjející třída terapeutik s vysokým potenciálem pro cílenou modulaci genové exprese. Pro vývoj, výrobní kontrolu a uvolňování takových produktů je nezbytné spolehlivé analytické zajištění identity, čistoty, integritiy duplexu a tepelné stability. Komplementární použití chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC/MS) a UV‑Vis termální analýzy poskytuje ortogonální pohled na strukturální vlastnosti siRNA a jejich závislost na formulaci a provozních podmínkách.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat integrovaný analytický workflow kombinující ion‑pair reverzní fázi LC/MS a UV‑Vis termální tání (Tm) pro komplexní karakterizaci siRNA duplexu (inclisiran). Konkrétně autoři porovnali analýzy provedené za nedestinujících (non‑denaturing) a denaturujících podmínek v LC/MS, stanovili optimální teplotu kolony pro zachování duplexu a změřili Tm v physiologickém pufru (PBS) a v LC elučním pufru obsahujícím organické složky, aby ukázali vliv složení rozpouštědla na stabilitu duplexu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Samply: Inclisiran jednotlivé řetězce a duplex koupené komerčně; vzorky rozpuštěny v RNase‑free vodě pro LC/MS (10 pmol/µL) a připravené duplexy ~20 µg/mL pro UV‑Vis.
• Chromatografie: Ion‑pair reverzní fáze (IP‑RP) se sloupcem Altura Oligo HPH‑C18 (2.1×50 mm, 2.7 µm). Mobilní fáze založená na 15 mM triethylaminu (TEA) a 100 mM hexafluoroisopropanolu (HFIP) ve vodě (solvent A) a směsi A:methanol 50:50 (solvent B). Gradient od 10 % do 70 % B během 10 minut, průtok 0.5 mL/min, injekce 2 µL. Teplota kolony testována v rozsahu 30–60 °C, aby se posoudila on‑column denaturace.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent InfinityLab Pro iQ Plus s ESI v negativním režimu; scan m/z 700–3 000; dekonvoluce spekter k určení molekulových hmot (MW) jednotlivých řetězců a duplexu.
• UV‑Vis Tm: Agilent Cary 3500 Multicell, měření při 260 nm, rampy z 25 → 90 °C rychlostí 5 °C/min, data interval 0.5 °C; měření prováděna v trojím opakování. K zabránění odpařování byl nad vzorky nanesen minerální olej.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC System (vč. vysokorychlostního pumpu, multisampleru, multikolonového termostatu a VWD detektoru).
• Agilent InfinityLab Pro iQ Plus mass detector (Agilent JetStream ESI zdroj).
• Agilent Cary 3500 Multicell UV‑Vis Spectrophotometer s inkuvetovým teplotním sondou a quarzovými semimicro kyvetami (800 µL, 10 mm).
• Software: Agilent OpenLab CDS pro LC/MS a Cary UV Workstation pro UV‑Vis data.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografie: Při nižších teplotách kolony (30–40 °C) byla siRNA detekována převážně ve formě duplexu a byly baseline separovány tři hlavní komponenty: antisense (AS), sense (SS, konjugovaná GalNAc) a duplex. Zvýšení teploty kolony vedlo k postupné on‑column denaturaci; při 60 °C byl duplex téměř úplně disociován na jednotlivé řetězce.
• Retenční chování: SS elutoval později než AS vlivem hydrofobní GalNAc konjugace. Šířka hlavního píku reflektovala částečné rozdělení diastereomerů a heterogenitu konformací.
• Hmotnostní spektrometrie: Měřené molekulové hmotnosti jednotlivých řetězců byly v dobré shodě s teoretickými hodnotami (v rámci přibližně 1–2 Da), čímž byla potvrzena identita komponent. Spektrum duplexu bylo složité kvůli překrývajícím se nabitostním stavům a aduktům, nicméně pokročilá dekonvoluce umožnila rozlišení a kvantifikaci složek.
• UV‑Vis Tm: Výrazný vliv složení rozpouštědla – v PBS byla naměřena vysoká Tm ≈ 82.5 °C, zatímco v LC elučním pufru obsahujícím TEA/HFIP a 25 % methanolu byla Tm výrazně nižší ≈ 46.8 °C. To ilustruje, že organické složky a iontová kompozice mobilní fáze silně destabilizují duplex.
• Konzistence mezi technikami: Pozorování z LC (teplotou indukovaná denaturace on‑column) korelovala s Tm hodnotami ze UV‑Vis, což potvrzuje komplementaritu obou přístupů pro hodnocení stability.

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace IP‑RP LC/MS a UV‑Vis Tm poskytuje ortogonální, robustní platformu pro QC siRNA: LC/MS potvrzuje identitu a čistotu (včetně rozlišení konjugovaných a nekonjugovaných řetězců), UV‑Vis určuje termální stabilitu a vliv formulace.
• Metoda je vhodná pro vývoj metod, porovnatelné studie (comparability), screening formulací, monitorování integrity duplexu během stability a pro rutinní analytické kontroly v biopharma prostředí.
• Praktické poznatky: u IP‑RP metod je třeba kontrolovat teplotu kolony, protože vyšší teploty mohou denaturovat duplex na koloně; složení elučního pufru výrazně ovlivní Tm a tím interpretaci LC výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Standardizace akceptačních kritérií pro hmotnostní potvrzení oligonukleotidů (rozsahy tolerancí v Da) a pro Tm ve specifických formulacích by zjednodušila regulaci a porovnávání dat mezi laboratořemi.
• Rozšíření použití nativní MS a vyššího rozlišení hmotnostních analyzátorů pro lepší zachycení intaktních duplexů bez on‑column denaturace.
• Automatizace workflow (přenos dat mezi LC/MS a UV‑Vis, integrovaná správa výsledků) a zrychlení throughputu pomocí multi‑cuveitních zařízení pro rychlý screening formulací.
• Využití metod pro screening chemických modifikací, konjugátů (např. GalNAc) a pro hodnocení vlivu excipientů na stabilitu v preklinickém a klinickém vývoji.

Závěr

Integrované použití IP‑RP LC/MS a UV‑Vis termální analýzy poskytuje silný a komplementární soubor nástrojů pro charakterizaci siRNA duplexů. LC/MS zajišťuje potvrzení identity, rozlišení jednotlivých komponent a informaci o heterogenitě, zatímco UV‑Vis Tm měření rychle kvantifikuje vliv prostředí na stabilitu duplexu. Společně tyto techniky podporují robustní analytické strategie pro vývoj, comparability a rutinní QC terapeutických siRNA produktů.

Reference

1. Gilar M., Redstone S., Gomes A. Impact of mobile and stationary phases on siRNA duplex stability in liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 2024;1733:465285.
2. Huang T.Y., Liu J., Liang X.R., Hodges B.D.M., McLuckey S.A. Collision‑Induced Dissociation of Intact Duplex and Single‑Stranded siRNA Anions. Anal. Chem. 2008;80(22):8501–8508.
3. Berezhnoy A., Brenneman R., Bajgelman M., Seales D., Gilboa E. Thermal stability of siRNA modulates aptamer‑conjugated siRNA inhibition. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2012;1:e51.
4. Agilent Technologies. Interview: Evaluating an Innovative Analytical ID Testing Strategy for Oligonucleotides. Agilent case study, publication number 5994‑5144EN; 2022.