Mass spectrometry-based structural analysis of oligonucleotide DNA duplexes

Význam tématu

Analýza struktury oligonukleotidových duplexů hraje zásadní roli při vývoji a kontrole kvality nových léčiv založených na DNA a RNA. Hluboké porozumění konformacím a agregaci nukleových kyselin v roztoku i plynové fázi přispívá k optimalizaci terapeutických vlastností a zajištění stability přípravků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat využití metodiky SEC-ESI-IM-MS pro rozlišení a charakterizaci DNA duplexů o různých délkách (24–72 nukleotidů) připravených buď jednoduchým promícháním, nebo plným annealingovým protokolem. Autoři zkoumali vliv přípravy vzorku na konformace v plynové fázi a měřili kolizní průřez (CCS) různých nabitých stavů.

Použitá metodika a instrumentace

Studie kombinovala chromatografii v ne-denaturujících podmínkách a iontovou mobilitu ve spojení s TOF hmotnostní spektrometrií.

• Chromatografie: ACQUITY Premier UPLC s BEH SEC 200 Å kolonkou, izokratický eluent 50 mM NH4OAc, 0,2 mL/min.
• Iontová mobilita-hmotnostní spektrometrie: SELECT Series Cyclic IMS v módu ESI+ Mobility TOF.
• Kalibrace CCS: polyalanin, BSA, Concanavalin A v 50 mM NH4OAc.
• Příprava vzorků: syntetické SS a AS řetězce (24–72 mer) v 10 mM Tris.HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 7,5), 200 pmol/µL.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy ukázaly jasné oddělení duplexních frakcí s minimálním zbytkem jednotlivých vláken. MS spektra pro duplexní píky vykazovala úzká rozdělení nábojových stavů s významou dominancí příslušných nabití.

• Iontová mobilita ATD pro krótnější duplexy (24mer) nevykazovala rozdíl mezi míchaným a annealovaným vzorkem.
• U delších struktur (36–72mer) se u annealovaného protokolu objevila vyšší prevalence kompaktnějších konformací (nižší CCS) než u jednoduchého míchání.
• Rozsah CCS odpovídal očekávaným hodnotám pro 7.–23. nábojový stav, což potvrzuje schopnost metody rozlišit jemné strukturální nuance.

Přínosy a praktické využití metody

SEC-ESI-IM-MS umožňuje komplexní profilování oligonukleotidových duplexů bez denaturace, včetně kvantifikace jednotlivých nabitých stavů a odhadu trojrozměrných rozměrů molekul. Metoda je vhodná pro vývoj a kontrolu kvality terapeutických aptamerů či antisense oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací iontové mobility pro studium modifikovaných nukleotidů, interakcí s proteiny či malými ligandy a dynamických přechodů mezi strukturálními stavy v reálném čase. Integrace s dalšími separačními technikami (HDX, cross-linking) by mohla dále zlepšit prostorové a časové rozlišení.

Závěr

Metoda kombinující ne-den-denaturující SEC s ESI-IM-MS prokazuje vysokou citlivost, selektivitu a schopnost odlišit konformace různě dlouhých DNA duplexů připravených různými způsoby. Annealingový protokol favorizuje kompaktnější struktury s menšími CCS, což může lépe odpovídat jejich nativnímu řešení.

Reference

• Gomes AF, Gilar M. Mass spectrometry-based structural analysis of oligonucleotide DNA duplexes. Waters Corporation; 2025.