Characterization and Sequencing of Duplex siRNA Using the BioAccord™ LC-MS System and Vion IMS QTof Mass Spectrometer in Combination With the waters_connect™ CONFIRM Sequence App

Význam tématu

Analýza siRNA duplexů je zásadní v kontextu genových terapií a moderních protinádorových léčiv. Přesné stanovení purity, identity a sekvence siRNA přispívá ke zajištění účinnosti a bezpečnosti léčivých produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje ucelenou LC-MS metodiku pro charakterizaci a sekvenování siRNA duplexů s využitím BioAccord LC-MS systému a Vion IMS QTof spektrometru ve spojení s aplikací waters_connect CONFIRM Sequence App. Cílem je demonstrovat možnosti analýzy duplexní i denaturované formy siRNA v jediném analytickém běhu.

Použitá instrumentace

• BioAccord LC-MS System: ACQUITY UPLC Premier I-Class PLUS, TUV detektor, ACQUITY RDa™ MS detektor
• Vion IMS QTof Mass Spectrometer
• waters_connect informatik platforma vč. INTACT Mass a CONFIRM Sequence Apps

Použitá metodika

Hybridizace siRNA duplexů byla provedena zahřátím na 75 °C s následným ochlazením. Chromatografie probíhala v ion-pair zpětně fázi (IP-RP) při dvou teplotách kolony (25 °C zachování duplexu, 60 °C denaturace). Data byla získána full-scan MSE režimem na BioAccordu a cílenou MS/MS analýzou na Vion IMS QTof.

Hlavní výsledky a diskuse

Na 25 °C je duplex na koloně stabilní, ale během ESI dochází k jeho rozdělení na jednotlivé řetězce, které jsou automaticky dekonvolvovány v INTACT Mass App. Při 60 °C se duplex chromatograficky rozpadne na sense a antisense řetězce, umožňující jejich samostatné měření. MSE data ukázala přibližně 90 % pokrytí sekvence v nondenaturačním režimu kvůli spektrálním interferencím, které byly odstraněny při denaturační separaci, čímž bylo dosaženo 100 % sekvenčního pokrytí s aplikací CONFIRM Sequence App. Cílená MS/MS analýza na Vionu potvrdila úplné pokrytí a čistotu spekter.

Přínosy a praktické využití metody

• Simultánní hodnocení purity, identity a sekvence siRNA z jednoho běhu
• Automatizované workflow přístupné ne-MS specialistům
• Kompatibilita s validovatelnými postupy pro výrobu a QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda se předpokládá jako univerzální pro další oligonukleotidy včetně chemických modifikací. Integrace ion mobility separace a plná automatizace datových toků vytvoří robustní nástroje pro GMP prostředí.

Závěr

Popsaná kombinace denaturační a nondenaturační LC-MS přístupu umožňuje komplexní charakterizaci siRNA duplexů. waters_connect aplikace usnadňují interpretaci a otevírají cestu k implementaci do vývojových i regulačních laboratoří.

Reference

1. Al Shaer D. et al. 2022 FDA TIDES Harvest. Pharmaceuticals. 2022;15(2):222.
2. Al Musaimi O. et al. 2023 FDA TIDES Harvest. Pharmaceuticals. 2023;16(3):336.
3. Al Shaer D. et al. 2024 FDA TIDES Harvest. Pharmaceuticals. 2024;17(2):243.
4. Rossi JJ, Rossi DJ. siRNA Drugs: Here to Stay. Molecular Therapy. 2021;29(2):431–432.
5. Gilar M. et al. Ion-Pair Reversed-Phase and HILIC Methods for Oligonucleotides. J. Chromatogr. A. 2023;1712:464475.
6. Cook K, Thayer J. Advantages of Ion-Exchange for Oligonucleotide Analysis. Bioanalysis. 2011;3(10):1109–1120.
7. Shimoyama A. et al. Evaluation of SEC for Phosphorothioate Oligonucleotides. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017;136:55–65.
8. Donegan M. et al. Effect of Ion-Pairing Hydrophobicity. J. Chromatogr. A. 2022;1666:462860.
9. Abdullah AM. et al. Tandem MS Sequence Characterization of Thymidine-Rich Oligos. J. Mass Spectrom. 2022;57(4):e4819.
10. Doneanu C. et al. HILIC as an Alternative Mode for Oligonucleotide Mass Confirmation. Waters App. Note 720007395. 2021.