Best Practice for Nucleic Acid Thermal Stability Measurements Using the Cary 3500 UV-Vis Spectrophotometer

Význam tématu

Určení teploty tání (Tm) nukleových kyselin je klíčové pro kvantifikaci kvality, stability a strukturální charakterizaci DNA/RNA. Tepelná denaturace poskytuje rychlý, nelineární ukazatel síly vodíkových vazeb mezi bázemi a umožňuje optimalizovat podmínky pro biochemické i průmyslové aplikace, například při návrhu PCR debug nástrojů, vývoji léků a studiu protein–nukleová interakcí.

Cíle a přehled studie / článku

White Paper popisuje doporučené postupy pro přesné a reprodukovatelné měření tepelné stability nukleových kyselin pomocí UV-Vis spektrofotometru Cary 3500 s Peltierovou kontrolou teploty. Cílem je minimalizovat artefakty a zajistit vysokou kvalitu dat optimalizací instrumentálních i vzorkových parametrů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda sleduje absorbanci při 260 nm během řízeného ohřevu či chlazení vzorku. Klíčové kroky:

• Volba quartzové kyvety (10 mm, 3,5 mL či mikroobjemy), vhodné pro UV rozsah.
• Řízení teploty: tři konfigurace Cary 3500 (Compact Peltier, Multicell Peltier, Multizone) umožňují regulaci buď přes vestavěný senzor bloku, nebo přes in-cuvette teplotní sondu.
• Optimalizace parametrů měření: šířka spektrálního pásma 1–2 nm, průměrovací čas 2–3 s, rychlost rampy ≤ 0,5 °C/min (při blokové regulaci) nebo až 40 °C/min (při sondové kontrole), interval dat ≤ 1 °C.
• Příprava vzorku: čištění kyvet, směrování paprsku, odstraňování kondenzace a bublinek, zabránění vypařování minerálním olejem či uzavřením kyvety.
• Míchání vzorku hvězdicovým magnetickým míchadlem (900 rpm) pro dosažení teplotní uniformity a odstranění plynů.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace doporučených postupů vedla k hladkým, šumově minimalizovaným křivkám tání a přesnému stanovení Tm z derivovaných křivek. Ukázalo se, že: řízené zahřívání/chlazení sníží hysterézi, in-cuvette sondy zajistí přesnější měření teploty vzorku než senzory bloku, a vzájemné používání konzistentních typů kyvet eliminuje systematické odchylky.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje:

• Rychlé a reprodukovatelné stanovení teploty tání nukleových kyselin.
• Možnost simultánního monitoringu až 7 vzorků (Multicell Peltier) či individuálních zón (Multizone).
• Širokou aplikovatelnost i pro proteiny, polymery či interakční studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat automatizaci přípravy vzorků, integraci s LIMS, vyspělé algoritmy analýzy tání v reálném čase a kombinaci s dalšími technikami (CD spektroskopie, fluorometrie). Rozšíření na vysokopropustné formáty umožní paralelní screening velkých knihoven sekvencí či ligandů.

Závěr

Dodržení popsáných postupů maximalizuje kvalitu dat a spolehlivost výsledků termální analýzy nukleových kyselin. Výběr správné kyvety, optimalizace parametrů instrumentu i vzorkových podmínek a využití in-cuvette sondy dovolují precizní stanovení Tm nezbytné pro řadu biochemických i farmaceutických aplikací.

Reference

1. Mergny JL, Lacroix L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 2003;13(6):515–537.
2. Bisswanger H. Enzyme Assays, Perspectives in Science. 2014;1(1-6):41–55.
3. Good NE, et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 1966;5(2):467–477.
4. Good NE, Izawa S. Hydrogen Ion Buffers. Methods Enzymol. 1972;24:53–68.