At the intersection between chromatographic performance, ESI efficiency and instrument productivity: nano to capillary flow LC/MS on long μPAC Columns

Význam tématu

Proteomika kombinující nízké až kapilární průtoky optimalizuje chromatografii i ionizaci pro hlubokou proteinovou analýzu s vysokou produktivitou. Zvýšení průtoku při zachování pokrytí proteomu je klíčové pro rychlou odezvu v biomedicínském výzkumu či QA/QC.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na uchování vysoké citlivosti při růstu vzorkové propustnosti (16–50 vzorků/den), testování jednotlivých a tandemových 110 cm µPAC Neo Plus kapilárních sloupců a určení optimálních průtoků pro různé délky gradientu.

Použitá instrumentace

• UHPLC Thermo Scientific Vanquish Neo
• µPAC Neo Plus kapilární kolony (110 cm)
• PepMap Neo kartridž pro trap-and-elute
• EASY-Spray zdroj s nanoViper 20 µm ID spojkou a ES993 emitorem (10 µm ID)
• Orbitrap Exploris 240/480 (DIA režim)
• 6-port nízkodisperzní přepínací ventily

Použitá metodika

• Příprava: HeLa digest v 0,1 % TFA, 1 % ACN, koncentrace 200 ng/µl, sonikace a zředění
• Režimy: trap-and-elute vs. tandemové zapojení dvou kolon mezi dvěma přepínacími ventily
• Gradienty a průtoky: 16–50 SPD, průtok 200–1000 nl/min, gradienty 16–100 min
• DIA parametry: MS1 120k, MS2 30k, AGC a izolace přizpůsobena délce gradientu

Hlavní výsledky a diskuse

• Při gradientech pod 30 min je optimální 1 µl/min, identifikováno až 6814 proteinových skupin z 500 ng (90 % kvantifikováno pod 20 % CV).
• Při gradientech nad 50 min a průtoku 200 nl/min dosaženo až 8556 proteinových skupin (16 SPD).
• Tandemové zapojení zvýšilo produktivitu o více než 25 %, s identifikací až 6947 proteinových skupin při 50 SPD, medián CV 7,2 % mezi kolony.
• Ventily s nízkou disperzí mají menší negativní vliv při vyšších průtocích (1 µl/min).
• Reprodukovatelnost mezi 5 kolony: variabilita počtu identifikací 0,7 %, retence PRTC peptide CV 0,99 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Udržení hlubokého pokrytí proteomu se zkrácením doby analýzy.
• Flexibilní volba režimu (jednokolonový vs. tandem) podle požadované propustnosti.
• Vysoká stabilita a reprodukovatelnost pro rutinní analýzy v proteomice a QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvyšování propustnosti s novými generacemi masových spektrometrů.
• Automatizace přepínání kolon a adaptivní optimalizace metod pomocí umělé inteligence.
• Multiplexní analýzy a integrace s dalšími omiky pro komplexní bioanalýzu.

Závěr

Optimalizace průtoků a využití dlouhých kapilárních µPAC Neo Plus kolon umožňuje zvýšit propustnost LC-MS proteomiky bez významného snížení hloubky pokrytí proteomu. Tandemové zapojení přináší další nárůst výkonu, což podporuje nasazení v rychlých a spolehlivých rutinních aplikacích.

Reference

• Zheng R., Rendl M., Valenta A.C., Pynn C., Lin Y., Daniliuk M., Aydin E., van Ling R., Taujenis L., Decrop W., Samonig M., Morgenstern A. A dual-column, single-spray configuration for capillary and micro-flow LC-MS applications. TN003314, Thermo Fisher Scientific.
• Thermo Fisher Scientific. µPAC Neo Plus application note.