Mastering Single Cell Proteomics: Daily Excellence with μPAC Neo Plus Trap-and-Elute Workflow

Význam tématu

Optimalizace single-cell proteomiky je klíčová pro pochopení buněčné heterogenity, mechanismů chorob a pro vývoj přesnějších biomedicínských aplikací. Metody, které snižují ztráty při zpracování ultranízkých vstupů a současně zvyšují citlivost LC‑MS analýzy a průchodnost (throughput), umožňují rutinní měření jednotlivých buněk a široké nasazení v biologickém i farmaceutickém výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentace je ukázat konstrukční principy a praktické přínosy µPAC Neo a µPAC Neo Plus pilířových nanoLC kolonek spolu s trap‑and‑elute workflow na platformách Thermo Fisher (Vanquish Neo, Orbitrap Exploris, Orbitrap Astral). Dokument sumarizuje: optimalizace separace pro nízké nano‑/piko‑gramové vstupy, strategie přiřazení průtoku pro zachování produktivity experimentu, dopad různých injekčních režimů (direct injection vs. trap‑and‑elute) a ukázkové výkony při měření jednotlivých HeLa buněk a ředěných vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolonky: µPAC Neo a µPAC Neo Plus (pilar‑array silicon micromachined columns). Konkrétní parametry pro 50 cm µPAC Neo Plus: pilířový prvek 5 µm, interpiliřová vzdálenost 1,25 µm, šířka kanálu ~180 µm, hloubka 16 µm, objem ~1,5 µL, povrch s core‑shell strukturou, porózní vrstva ~400 nm, velikost pórů 100–300 Å, povrchová modifikace C18 + HMDS.
• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC s možností přesného nasávání objemů 10 nL–100 µL a režimu vial bottom detection pro úplné odsátí vzorku.
• Ionizace a zdroj: Thermo Scientific OptiSpray ion source / cartridges s 3D pozicováním emitru, plug‑and‑play kazetami a automatickou optimalizací.
• MS platformy: Orbitrap Exploris 240 (uvedené výsledky DIA/120k MS2 nastavení) a Orbitrap Astral (vyšší citlivost a průchodnost pro hlubší pokrytí proteomu).
• Workflows: direct injection (DI) a trap‑and‑elute v režimech backward flush (BWF) a forward flush (FF); variabilní proudové strategie (gradient formován při vysokém průtoku s přepnutím na nízký proud při eluční fázi) pro maximalizaci produktivity a citlivosti.
• Data processing: Spectronaut v19 (včetně Match Between Runs), zpracování replikovaných běhů a nastavení MS parametrů pro DIA (např. 120k MS2, maxIT ~246 ms, okna ~80 Th v určitých experimentech).

Hlavní výsledky a diskuse

• Pilar‑array konstrukce µPAC Neo/Neo Plus přináší homogenní proudění a snížení difuze oproti konvenčním packed‑bed kolonám, což vede ke zúženým chromatografickým špičkám a zvýšené intenzitě signálu při nízkých průtocích (sub‑200 nL/min).
• Generační zlepšení: µPAC Neo2/Neo Plus používají interpiliřovou vzdálenost 1,25 µm (oproti 2,5 µm u první generace), což zvyšuje separační výkon a citlivost pro ultranízké nálože.
• 50 cm µPAC Neo Plus nabízí optimální kombinaci citlivosti a robustnosti pro vzorky ≲100 ng; doporučené průtoky 100–750 nL/min a gradienty do 60 min pro rutinní nasazení.
• Režimy naložení vzorku: Direct injection při koncentrovaných malých objemech (10–50 nL) poskytuje nejlepší proteomickou hloubku. Přechod na backward flush trap‑and‑elute znamená přibližně 10% snížení počtu identifikovaných proteinových skupin (PG) oproti DI; forward flush vede k dalšímu snížení (20–40% oproti BWF). Hlavní příčinou je rozšíření špiček (peak width) spíše než ztráta hydrofilních peptidů.
• Produktivita: použití variabilního průtoku, kdy je gradient částečně nebo plně formován při vyšším průtoku a před eluční fází se přepne na nízký průtok, umožní zachovat vysokou instrumentální průchodnost (až ~75–83% v ukázkách) a současně dosáhnout citlivosti nízkoprůtokových režimů.
• Výkony: Rutinně dosažitelné hodnoty jsou v rozsahu ~2000 identifikovaných proteinových skupin na buňku (Orbitrap Exploris) při workflows s 30 vzorky/den; µPAC Neo2 v trap‑and‑elute bez detergentu (DDM) při 250 pg dokáže dosahovat podobného počtu ID (~6000 PG a ~40000 peptidů při 1% FDR) jako direct injection s DDM za optimálních podmínek (data z benchmarků a beta testů).
• Vliv velikosti buňky: větší buňky (HeLa selektované podle velikostních binů) vykazují lepší proteomické pokrytí a menší variabilitu, čímž se zvyšuje konzistence dat v single‑cell experimentech.

Přínosy a praktické využití metody

• µPAC Neo/Neo Plus dovolují zvýšit citlivost při nízkých průtocích bez zásadného zhoršení robustnosti, což je kritické pro analýzy jednotlivých buněk a velmi vzácných buněčných populací.
• Trap‑and‑elute workflow v kombinaci s Vanquish Neo umožňuje pracovat s proměnlivými objemy skutečných single‑cell přípravků (1–10 µL) a minimalizovat ztráty vzorku díky plnému odsátí ze dna vialu.
• Strategie formování gradientu při vyšším průtoku a následné přepnutí na nízký průtok zvyšuje instrumentální produktivitu bez výrazného kompromisu citlivosti, což je důležité pro studie s vysokým počtem buněk/reakcí.
• OptiSpray zdroj a kazetový systém zjednodušují nasazení nano‑ESI pro méně zkušené uživatele a zvyšují reprodukovatelnost mezi kolonkami a uživateli.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále vylepšené pilar‑array konstrukce (další zmenšování interpilířové vzdálenosti a optimalizace porozity povrchů) posune hranice citlivosti a separační kapacity pro ultranízké vstupy.
• Integrace s rychlejšími a citlivějšími MS platformami (např. Orbitrap Astral) umožní hloubější proteomické profilování při vyšší průchodnosti a krátkých gradientech.
• Automatizované workflowy pro izolaci buněk (např. cellenONE), standardizovaná velikostní třídění buněk a robustní on‑plate digestion zvýší srovnatelnost a opakovatelnost single‑cell dat napříč laboratořemi.
• Pokročilé algoritmy zpracování dat (DIA, MBR, machine‑learning based identifikace) budou důležité pro extrakci informace z nízkosignalových dat a pro konsolidaci výsledků mezi experimenty.
• Potenciál průmyslového nasazení: aplikace v drug‑developmentu, biomarker discovery a personalizované medicíně, kde je klíčové analyzovat heterogenitu populace na úrovni jednotlivých buněk.

Závěr

µPAC Neo/Neo Plus pilar‑array kolony v kombinaci s optimalizovanými trap‑and‑elute protokoly a variabilními průtokovými strategiemi poskytují praktickou cestu k rutinní single‑cell proteomice. Technologie snižuje chromatografické ztráty, zvyšuje intenzitu signálu při nízkých průtocích a umožňuje rozumný kompromis mezi citlivostí a produktivitou. Vhodná instrumentální kombinace (Vanquish Neo + OptiSpray + Orbitrap Exploris/Astral) a pečlivé nastavení workflowů dovolují dosahovat stovek až tisíců proteinových identifikací na buňku a umožňují jejich použití ve vědeckých i aplikovaných kontextech.

Reference

• He, B.; Tait, N.; Regnier, F. Fabrication of Nanocolumns for Liquid Chromatography. Analytical Chemistry 1998, 70, 3790–3797.
• Gzil, P.; Vervoort, N.; Baron, G. V.; Desmet, G. Advantages of perfectly ordered 2‑D porous pillar arrays over packed bed columns for LC separations: a theoretical analysis. Analytical Chemistry 2003, 75, 6244–6250.
• Prezentace a data: Jeff Op de Beeck, Thermo Fisher Scientific. Mastering Single Cell Proteomics: Daily Excellence with µPAC Neo Plus Trap‑and‑Elute Workflow, seminar LSMBO, Strasbourg, 11.12.2025 (materialy z ledna 2026).