A dual-column, single-spray configuration for capillary and micro-flow LC-MS applications

Význam tématu

Proteomická analýza vyžaduje vysokou citlivost, reprodukovatelnost a maximální využití hmotnostního spektrometru. Tandemní přímá injekční konfigurace kapilární a mikroproudové LC-MS nabízí významné zvýšení propustnosti a robustnosti analýzy, aniž by došlo ke ztrátě citlivosti.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje použití tandemního přímého injekčního workflow na systému Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC pro kapilární a mikroproudové separace. Cílem je ukázat, jak dosáhnout téměř 100% využití MS detekce, vysoké propustnosti (až 277 vzorků/den) a nízkého carryover.

Použitá metodika a instrumentace

Tandemní konfigurace využívá jediný ESI emitér, dvě kolony (150 µm, 300 µm a 1 000 µm I.D.) propojené přepínacími ventily, samostatné pumpy pro separaci a rekuperaci, nanoViper™ kapiláry (20 µm a 50 µm I.D.), Orbitrap Exploris 240 pro data-independent acquisition (DIA) a CHIMERYS™ či Spectronaut™ 19 pro zpracování dat. Metodika zahrnuje automatické měření odporu kolon, inteligentní nastavení solventních parametrů a přednastavené mycí cykly.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované flow rate 1–5 µL/min na 150 µm kolónách poskytly MS využití >90 % a identifikaci 3 111–4 281 proteinů při 200 ng HeLa digestu s CV <20 %. Přechod na mikroproudovou separaci (15 µL/min na 300 µm kolóně) přinesl 2 200 proteinů při throughput 240 vzorků/den. Při 100 µL/min na 1 000 µm kolóně dosáhli až 277 vzorků/den a ~2 400 proteinů. Použití nanoViper trap kolony výrazně prodloužilo životnost separačních kolon bez významného ovlivnění proteomického pokrytí. Carryover bylo při vysokopropustných metodách minimalizováno na 0,03–0,008 % díky rozšířeným mycím protokolům.

Přínosy a praktické využití metody

• Maximální využití MS detekce (>90 %) šetří čas a zvyšuje citlivost.
• Vysoká propustnost až 277 vzorků/den vhodná pro rutinní proteomiku.
• Jeden emitér eliminuje variabilitu mezi sprayi a prodlužuje jeho životnost.
• Nízké carryover a konsistentní retence umožňují spolehlivé kvantifikace.
• Modulární nastavení podporuje kapilární i mikroproudové módy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj automatizace a online monitoringu flow parametrů, integrace inteligentních algoritmů pro optimalizaci metod a rozšíření aplikací do klinických a farmaceutických laboratoří slibuje další zvýšení efektivity. Kombinace s ion mobility separací či vysokorychlostními detektory může dále prohloubit proteomické pokrytí a kapacitu workflow.

Závěr

Tandemní přímá injekce na Vanquish Neo UHPLC s jedním emitérem přináší zásadní zrychlení proteomického workflow, vysokou reprodukovatelnost, nízké carryover a maximální využití MS detekce. Metoda nabízí flexibilní přechod mezi kapilárními a mikroproudovými režimy a výrazně prodlužuje životnost kolon.

Reference

1. Zheng R. et al. Maximizing sample throughput and sensitivities in nano and capillary LC-MS: harnessing the advantage of a tandem direct injection workflow and a double barrel ion source. Thermo Fisher Scientific Technical Note 003335, 2024.
2. Bian Y. et al. Robust, reproducible and quantitative analysis of thousands of proteomes by micro-flow LC–MS/MS. Nature Communications 2020;11:157.
3. Thermo Fisher Scientific. Vanquish Neo System User Guide Revision 2.0, 2024.
4. Staes A. et al. High-throughput nanoflow proteomics using a dual-column electrospray source. Analytical Chemistry 2024;96(17):6534–6539.
5. Zheng R. et al. Fast, sensitive, and reproducible nano- and capillary-flow LC-MS methods for high-throughput proteome profiling using Vanquish Neo UHPLC with Orbitrap Exploris 480. Thermo Fisher Scientific Technical Note 000138, 2021.
6. Meding S. et al. Ultra-robust micro-flow LC-MS/MS for targeted high-throughput peptide quantification using the Vanquish Neo UHPLC system. Thermo Fisher Scientific Technical Note 74161, 2021.