Efficient tandem capillary flow LC-MS with short μPAC columns and a single ionization source

Význam tématu

Vysokoprůchodová proteomika hraje klíčovou roli při rychlé charakterizaci komplexních proteinových vzorků v biomedicínském výzkumu, diagnostice i průmyslové analytice. Optimalizace LC-MS metod s cílem zvýšit počet vzorků za jednotku času při zachování citlivosti a reprodukovatelnosti umožňuje efektivní měření v rutinní i výzkumné praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje výkon, robustnost a zvýšení produktivity Tandem Direct Injection (TDI) workflowu pro kapilární průtokové LC-MS s využitím nových µPAC Neo High-Throughput Plus kolon a jednoho ESI zdroje. Cílem bylo porovnat výtěžnost identifikací proteinových skupin a stabilitu metody napříč různými průtokovými režimy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: HeLa celulární digesty, resuspendované v 0,1% TFA a 1% ACN (200 ng/µL), sonikace, 10 µL injekční smyčka.
LC-MS konfigurace: tandemové uspořádání Vanquish Neo UHPLC s dvěma pumpami a 6-portovými ventily s nízkou disperzí, dvě µPAC Neo HT Plus kolony, 20 µm nanoViper linka, EASY-Spray ionizační zdroj, Orbitrap Exploris 240 s DIA nastavením (MS1 rozlišení 60k/120k, MS2 15k/30k; AGC 300%/800%; šířky izolace 8–15 Th dle metody).

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC se dvěma pumpami
• µPAC Neo High-Throughput Plus kapilární kolony
• 6-portové přepínací ventily s nízkou disperzí
• Thermo Scientific EASY-Spray ESI zdroj
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 MS
• nanoViper 20 µm I.D. kapilára

Hlavní výsledky a diskuse

• Produktivita se oproti jedné koloně zvýšila o 30 % (200 SPD) a o 17 % (100 SPD).
• Při 200 SPD a průtoku 2,5 µL/min dosaženo až 3 663 proteinových skupin; při 180 SPD až 4 731; při 100 SPD až 5 692.
• Střední CV identifikací na úrovni proteinových skupin se pohybovalo mezi 5–7 % (n = 6), variabilita mezi kolonami kolem 7–8 %.
• Vysoká reprodukovatelnost retencí PRTC peptidů napříč 12 kolony (CV 1,4–3,3 %).
• Porovnání emitterů (15 µm VS 30 µm ID) neovlivnilo významně ID, FWHM ani TIC; nižší průtok 1 µL/min způsobil mírné rozšíření píku, ale zvýšení ionizační účinnosti.

Přínosy a praktické využití metody

Díky tandemovému zapojení kolon a optimalizovaným gradientům lze zvýšit denní výkon laboratoře při zachování vysoké kvality dat. Metoda je vhodná pro velkoobjemové pořizování dat v proteomice, rutinní QA/QC i akademický výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace real-time monitoringu a adaptivních gradientů pro další zvýšení efektivity.
• Rozšíření na multiplexní workflowy a snadné přepínání mezi režimy nízkého a vysokého průtoku.
• Nasazení v klinických a průmyslových laboratořích s požadavkem na vysokou průchodnost.
• Další miniaturizace a automatizace přípravy vzorku v návaznosti na TDI konfiguraci.

Závěr

Tandem Direct Injection konfigurace s µPAC Neo HT Plus kolonami a Vanquish Neo UHPLC výrazně zvýšila produktivitu LC-MS měření bez kompromisů v citlivosti a přesnosti. Metoda prokázala vysokou stabilitu a reprodukovatelnost napříč řadou produkčních šarží kolony, což podporuje její nasazení v rutinní i výzkumné praxi.

Reference

1. Zheng R., Rendl M., Valenta A.C., Pynn C., Lin Y., Daniliuk M., Aydin E., van Ling R., Taujenis L., Decrop W., Samonig M., Morgenstern A. A dual-column, single-spray configuration for capillary and micro-flow LC-MS applications, Application Note TN003314, Thermo Fisher Scientific.