Method transfer case study for instrument and LC column migration of the purification and analysis workflow for synthetic oligonucleotides

Význam tématu

Oligonukleotidová purifikace je zásadní pro získání vysoce čistých cílových sledů používaných v diagnostice, farmaceutickém výzkumu a biochemii. Efektivní odstranění vedlejších produktů syntézy, truncátů a rozkladných látek fluoroforů či quencherů zajišťuje spolehlivost následných aplikací, včetně farmakokinetických či analytických studií.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem práce bylo demonstrovat bezproblémový přenos metody purifikace a kvalifikace dvou 15mer dvojnásobně značených oligonukleotidů (ABY-MGB, JUN-MGB) z ne-Thermo Fisher instrumenčního a kolonového řešení na platformu Thermo Scientific Vanquish LC. Studie porovnala výkon původního Daisogel semi-preparativního stupně s novou Hypersil GOLD semi-preparativní kolonou a následně ověřila kvalitu analytickou fází (LC-UV, LC-HRAM MS) ve Chromeleon CDS.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Analytical Purification LC systém
• Daisogel SP-100 ODS-P semi-preparativní kolona (10×150 mm, 5 µm)
• Hypersil GOLD C18 Prep kolona (10×150 mm, 5 µm)
• Vanquish Flex Binary UHPLC pro LC-UV QC
• Waters ACQUITY UPLC BEH C18 analytická kolona (2.1×50 mm, 1.7 µm)
• Hypersil GOLD C18 RP analytická kolona (2.1×50 mm, 1.9 µm)
• Chromeleon CDS 7.3.2 pro akvizici a zpracování dat
• LC-HRAM MS pro identifikaci a potvrzení identity oligonukleotidů

Použitá metodika

Oligonukleotidy byly nejprve preparativně čištěny gradientní RP-HPLC metodou s 100 mM TEAA a směsí MeCN/MeOH na semi-preparativních kolonách. Po porovnání kolony Daisogel a Hypersil GOLD byly shromážděné frakce analyzovány pomocí LC-UV (260, 350, 560 nm) pro určení čistoty a objemu. Pro potvrzení identity a absenci neaplikovatelných impurit byla použita LC-HRAM MS. Kvalita analytické fáze byla ověřena na Waters a Hypersil GOLD kolónách pod identickými podmínkami.

Hlavní výsledky a diskuse

• Hypersil GOLD semi-preparativní kolona dosáhla vyššího rozlišení špiček vůči Daisogel, zejména při purifikaci JUN-MGB, kde vedlejší špičky byly ostřeji odděleny.
• Čistoty po semi-preparativní purifikaci: ABY-MGB dosáhla 99.70 % (vs. 98.41 % na Daisogel), JUN-MGB 99.92 % (vs. 98.76 %).
• Analytická komparace Waters vs. Hypersil GOLD vykázala srovnatelnou čistotu a výtěžek: očištěné frakce dosáhly až 99.7–99.9 % čistoty.
• Metoda transferu byla potvrzena srovnatelnými výsledky kvantitativního určení a kvality mezi původními a novými stanicemi.

Přínosy a praktické využití metody

Tento transfer metodiky umožňuje laboratořím přechod na jednotné Thermo Fisher řešení bez ztráty výkonu. Hypersil GOLD kolony poskytují flexibilitu v dělení a vyšší rozlišení, což usnadňuje purifikaci složitějších sekvencí. Celá workflow integrována do Chromeleon CDS zrychluje akvizici a analýzu dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další optimalizace gradientů pro různé délky a modifikace oligonukleotidů, rozšíření použití v sekvenování a genové terapii a adaptace na automatizované high-throughput platformy. Vývoj nových peptidických mřížek či hybridních materiálů v kolonách může dále zlepšit separační efektivitu.

Závěr

Demonstrovaný přenos metody potvrdil, že Thermo Scientific Vanquish platforma s Hypersil GOLD kolony dokáže efektivně nahradit ne-Thermo Fisher systém bez kompromisu na kvalitě a výtěžku oligonukleotidů. Celý proces je plně kompatibilní s Chromeleon CDS a rozšiřuje možnosti QC a purifikace ve farmaceutickém i výzkumném prostředí.

Reference

1. Roberts et al. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Rev. Drug Discov. 2020, 19, 673–694.
2. Zhang et al. Recent Methods for Purification and Structure Determination of Oligonucleotides. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(12), 2134.
3. Catani et al. Oligonucleotides: Current Trends and Innovative Applications in the Synthesis, Characterization, and Purification. Biotechnol. J. 2020, 15(8), 1900226.
4. Kanwal et al. Large-Scale in Vitro Transcription, RNA Purification and Chemical Probing Analysis. Cell. Physiol. Biochem. 2018, 1915–1927.