Method transfer case study for instrument and LC column migration of the purification and analysis workflow for synthetic oligonucleotides

Význam tématu

Oligonukleotidy se stále častěji využívají v biochemickém výzkumu, diagnostice a farmacii. Jejich syntéza však vede ke vzniku vedlejších produktů a nečistot, které musí být efektivně odstraněny, aby výsledné činidlo splňovalo požadavky na čistotu i výtěžnost. Přenos chromatografických metod mezi různými platformami a sloupci zvyšuje flexibilitu laboratoře a umožňuje optimalizovat workflow s ohledem na dostupné přístroje.

Cíle a přehled studie

Úkolem studie bylo přenést semi-preparační a analytickou RP-HPLC metodu pro purifikaci a kontrolu kvality duálně značených 15mer oligonukleotidů z nekonkurentního LC systému a kolony na platformu Thermo Scientific Vanquish s použitím:

• semi-preparační purifikační LC (Vanquish Analytical Purification)
• analytického UHPLC (Vanquish Flex Binary UHPLC)
• LC-HRMS (Orbitrap Exploris 480) pro potvrzení hmotnosti a čistoty

Použitá instrumentace

• Vanquish Analytical Purification LC System s Vanquish Binary Pump, Split Sampler FT, Column Compartment H, Diode Array Detector a Fraction Collector
• Vanquish Flex Binary UHPLC System pro LC-UV QC
• Orbitrap Exploris 480 pro LC-HRMS QC
• Savant SpeedVac SPD1010 pro koncentraci frakcí
• SpectraMax 384+ UV-Vis spektrofotometr pro kvantifikaci

Použitá metodika

Studie zahrnovala čtyři kroky:

1. Purifikace na semi-preparačním RP-HPLC: porovnání Daisogel SP-100 ODS-P a Hypersil GOLD kolony pomocí gradientu TEAA/MeCN:MeOH při 4,5 mL/min a 50 °C.
2. LC-UV QC: analýza hrubých i čistých vzorků na Waters ACQUITY UPLC BEH C18 a Hypersil GOLD analytické kolony s gradientem TEAA/MeCN:MeOH při 0,6 mL/min a 50 °C.
3. LC-HRMS QC: separace na Waters Atlantis T3 kolonu s proprietárními mobilními fázemi a detekce v Orbitrapu, dekonvoluce pomocí Xtract v FreeStyle.
4. Kvantifikace: absorbance při 260 nm ve SpektraMaxu a výpočet koncentrace podle Beer-Lambertova zákona.

Hlavní výsledky a diskuse

Purifikace ukázala, že Hypersil GOLD kolona poskytuje vyšší rozlišení než Daisogel, menší objem frakcí a umožňuje snadnější odstranění sousedních nečistot. Hypersil GOLD semi-preparační kolona dosáhla čistoty nad 99 % pro oba vzorky (ABY-MGB i JUN-MGB) a snížila objem frakcí oproti Daisogel o více než 15 %.
LC-UV QC prokázalo, že přenos analytické metody na Hypersil GOLD analytickou kolonu dává obdobné čistoty jako Waters UPLC kolona (>99 %), což potvrzuje úspěšný přenos metody.
LC-HRMS nepotvrdilo výskyt zásadních nečistot a naměřená monoisotopická hmotnost odpovídala očekávané hodnotě ± 0,2 Da.
Kvantifikace po koncentraci frakcí odhalila výtěžky kolem 45–48 nmol, srovnatelné mezi zdrojovou a Vanquish platformou.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost přímého přenosu purifikačních a QC protokolů mezi různými LC platformami
• Využití Thermo Scientific Vanquish pro zvýšení flexibility laboratoře
• Snížení objemu frakcí a zkrácení času přípravy díky optimálnějšímu sloupci a nastavení
• Spolehlivá kontrola kvality kombinací LC-UV a LC-HRMS

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení vysoce výkonných UHPLC systémů pro automatizovanou purifikaci a QC oligonukleotidů, včetně online frakční sběru a real-time hmotnostní detekce. Dále lze integrovat rychlé evaporátory či lyofilizátory pro ochranu integrity oligonukleotidů a zkrácení doby přípravy.

Závěr

Metoda pro purifikaci i kontrolu kvality duálně značených 15mer oligonukleotidů byla úspěšně přenesena z nekonkurentního systému na kompletní Thermo Scientific workflow založené na Vanquish a Orbitrap Exploris. Hypersil GOLD sloupce prokázaly vynikající výkonnost a umožnily konsistentní čistoty a výtěžky, čímž podpořily flexibilitu a výkonnost analytických laboratoří.

Reference

1. Roberts a kol. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery 2020, 19, 673.
2. Zhang a kol. Recent methods for purification and structure determination of oligonucleotides. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(12), 2134.
3. Catani a kol. Oligonucleotides: Current trends and innovative applications. Biotechnol. J. 2020, 15(8), 1900226.
4. Kanwal a kol. Large-scale in vitro transcription, RNA purification and chemical probing analysis. Cell. Physiol. Biochem. 2018, 48, 1915.
5. Cramer a kol. Purity analysis and impurities determination by RP-HPLC. In Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products; CRC Press 2011; 1–46.