Method transfer for the purification of synthetic oligonucleotides

Význam tématu

Purifikace syntetických oligonukleotidů je klíčová pro jejich využití ve vysoce citlivých aplikacích jako qPCR, forenzní testy či genová terapie. Řízená separace a odstranění nečistot zvyšuje spolehlivost a přesnost následných analýz a minimalizuje riziko interferencí.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje kompletní přenos metody pro purifikaci dual-značkovaných 15mer oligonukleotidů z konkurenčního LC a kolonového workflow na řešení Thermo Fisher Scientific. Hlavním cílem byla validace podmínek pro HPLC purifikaci, následnou kvalitativní kontrolu pomocí LC-UV a potvrzení integrity produktů pomocí LC-HRMS pod řízením Chromeleon CDS.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Reverzní fáze na bázi trimetylamonia acetátu (TEAA) s gradientem MeCN/MeOH.
• Peak-based purifikace pro izolaci cílových fragmentů.
• QC pomocí LC-UV analyzátoru.
• Hmotnostní identifikace a kvantifikace pomocí vysokorozlišovacího Orbitrap Exploris 480 MS.

Instrumentace:

• HPLC purifikace: Agilent 1260 Infinity II Preparative-Scale LC a Thermo Scientific Vanquish Analytical Purification LC System.
• Chromeleon 7.3.2 CDS pro řízení purifikace a LC-UV QC.
• Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC pro LC-UV.
• Kolony: Thermo Scientific Hypersil GOLD C18 (analytická a semi-preparativní).
• MS detekce: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 s Xcalibur a FreeStyle softwarem.

Hlavní výsledky a diskuse

• Úspěšný přenos kompletního workflow srovnatelných výtěžků a čistot mezi Agilent a Vanquish systémy.
• Hypersil GOLD kolony dosáhly podobné selektivity a kapacity jako konkurenční kolony se sníženým objemem frakce.
• LC-UV a LC-HRMS potvrdily očekávanou monoisotopickou hmotnost produktů bez kritických nečistot.
• Výsledky ukazují nevýznamné rozdíly ve výnosech a čistotě mezi zdrojovým a převzatým řešením.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje laboratořím snadno přejít na řešení Thermo Fisher Scientific bez kompromisů v kvalitě a efektivitě. Standardizované postupy zkracují dobu validace a zvyšují flexibilitu přístupu k různým oligonukleotidům.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a integrace do high-throughput platforem pro paralelní purifikaci.
• Vývoj nových stacionárních fází optimalizovaných pro krátké fluorescenčně značené oligonukleotidy.
• Rozšíření metody pro modifikované nebo konjugované sekvence a přípravu pro klinické aplikace.

Závěr

Demonstrace bezproblémového přenosu metody potvrzuje, že řešení Thermo Fisher Scientific poskytuje spolehlivou alternativu ke konkurenčním systémům. Uživatelé získají konzistentní výtěžky a čistoty bez nutnosti zásadních změn metodiky.

Reference

• Roberts M. et al. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 2020;19:673–694.
• Zhang H. et al. Recent Methods for Purification and Structure Determination of Oligonucleotides. International Journal of Molecular Sciences. 2016;17(12):2134.