Instrument and LC column migration for the purification and analysis of synthetic oligonucleotides

Význam tématu

Oligonukleotidy jsou klíčové pro biochemický výzkum, diagnostiku i farmaceutický vývoj a vyžadují vysokou čistotu.
Syntéza oligonukleotidů generuje nečistoty, jako jsou zkrácené sekvence a degradované značky, které je nutné oddělit.
Reverzní fázová chromatografie (RP-HPLC/UHPLC) patří mezi nejrozšířenější techniky pro purifikaci a analýzu oligonukleotidů.
Migrace metod mezi různými LC platformami usnadňuje standardizaci pracovních postupů v laboratořích.

Cíle a přehled studie / článku

Prezentovaná případová studie se zaměřuje na komplexní přenos workflow polopreparativní RP-HPLC purifikace a následné kvalifikace syntetických dvoufluorofor-/dvouquencher-znakovaných oligonukleotidů z nestandardního HPLC systému Agilent 1260 Infinity II na platformu Thermo Fisher Scientific Vanquish LC.
Cílem bylo srovnat výkonnost původního a cílového systému v oblasti purifikace (výnos, čistota) a následné analýzy pomocí HPLC-UV a UHPLC-HRAM-MS v prostředí Chromeleon CDS.

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny rozpouštěním hrubých duálně značených oligonukleotidů v 100 mM roztoku triethylamoniového acetátu (TEAA) a organické fází (1:1 MeCN:MeOH) s vortexováním a sonikací.
Purifikace probíhala na Vanquish Analytical Purification LC systému s gradientem TEAA/MeCN:MeOH a polopreparativními sloupci Daisogel SP-100 ODS-P a Hypersil GOLD C18.
Čistota frakcí se ověřovala LC-UV analytikou na Waters ACQUITY UPLC BEH C18 a Hypersil GOLD analýze, výnos stanoven spektrofotometricky absorbancí při 260 nm a identita potvrzena UHPLC hyphenovanou HRAM-Orbitrap MS.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Analytical Purification LC System
• Vanquish Flex Binary UHPLC (pumpa, autosampler, komora, DAD detektor)
• Vanquish Fraction Collector
• Savant SpeedVac SPD1010 koncentrátor
• Molecular Devices SpectraMax 384+ UV-Vis fotometr
• Thermo Scientific Orbitrap-based HRAM-MS
• Agilent 1260 Infinity II Preparative-Scale LC (referenčně)
• Waters ACQUITY UPLC BEH C18 a Thermo Scientific Hypersil GOLD kolony

Hlavní výsledky a diskuse

Přenos metody z HPLC Agilent na Vanquish LC pro ABY-MGB a JUN-MGB 15mer oligo vedl k obdobným výnosům (~45–48 nmol) a čistotám (>98 %) na obou platformách.
Polopreparativní Hypersil GOLD sloupec poskytl lepší rozlišení sousedních nečistot a redukoval objem sběru frakcí ve srovnání s Daisogel SP-100.
Hypersil GOLD analytický sloupec dosáhl ekvivalentní kvality LC-UV QC k Waters ACQUITY UPLC BEH C18 a umožnil přímou výměnu metod.
Dlouhý čas sušení frakcí (SpeedVac) vedl k mírné degradaci produktů; doporučuje se minimalizovat dobu a teplotu koncentrace.

Přínosy a praktické využití metody

• Jedna konzistentní platforma Vanquish LC pro purifikaci i analýzu zkracuje dobu validace a zvyšuje flexibilitu laboratoře.
• Standardizované kolony Hypersil GOLD umožňují jednodušší přenos metod mezi týmy a lokalitami.
• Data spravovaná v Chromeleon CDS zajišťují přehlednost a auditovatelnost postupů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření workflow na purifikaci delších oligonukleotidů a modifikovaných nukleotidů s vyššími nároky na separaci.
Integrace online hyphenace s MS pro okamžitou kontrolu identity během frakčního sběru.
Automatizace přípravy vzorků a zkrácení času koncentrace za použití nízkoteplotních metod.

Závěr

Studie potvrdila úspěšný přenos metody RP-HPLC purifikace a analýzy syntetických oligonukleotidů mezi LC platformami srovnatelnými výnosy, čistotou i potvrzenou identitou.
Thermo Scientific Vanquish LC řešení v kombinaci s Hypersil GOLD sloupci představuje robustní a přenosnou workflow pro QC i purifikaci oligonukleotidů.
Minimalizace expozice produktů teplu a času sušení vede k vyšší stabilitě finálních frakcí.

Reference

• Roberts et al. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery, 2020, 19, 673.
• Zhang et al. Recent methods for purification and structure determination of oligonucleotides. Int. J. Mol. Sci., 2016, 17(12), 2134.
• Catani et al. Oligonucleotides: Current trends and innovative applications in the synthesis, characterization, and purification. Biotechnol. J., 2020, 15(8), 1900226.
• Kanwal et al. Large-scale in vitro transcription, RNA purification and chemical probing analysis. Cell. Physiol. Biochem., 2018, 48, 1915.
• Cramer et al. Purity analysis and impurities determination by RP-HPLC. In Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products; CRC Press, 2011; pp. 1–46.