Semi-preparative reversed-phase liquid chromatographic purification of oligonucleotides

Význam tématu

Využití syntetických oligonukleotidů v biochemickém výzkumu, diagnostice i jako léčiv roste zásluhou jejich přesné specifity a biologické aktivity. Pro aplikace jako qPCR, forenzní analýzy či genová terapie je klíčové dosáhnout vysoké čistoty cílové sekvence bez směsi vedlejších produktů syntézy. Semi-preparativní reverzní fáze HPLC nabízí spolehlivou cestu k izolaci a konfekci vysoce čistých oligonukleotidů ve vyšším objemu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem předložené práce bylo ukázat integrované použití systému Thermo Scientific Vanquish Analytical Purification LC s automatickým fraction collectorem pro semi-preparativní RP-LC purifikaci tří různých 25mer duálně značených oligonukleotidů dodaných firmou Eurofins Genomics. Studie demonstruje snadnou implementaci, flexibilitu metody a následnou reanalýzu separovaných frakcí pro ověření účinnosti čištění.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z RP-HPLC na C18 kolóně (10×100 mm, 5 µm, 130 Å) při teplotě 60 °C s mobilními fázemi

• A: 50 mM TEAA pH 7 s 5 % acetonitrilem
• B: čistý acetonitril

Gradient probíhal od 0 % do 50 % fáze B během 31 min při průtoku 5 mL/min. Vzorky byly připraveny v 400 µM koncentraci, objem injekce 500 µL. Instrumentace:

• Vanquish Flex Analytical Purification LC
• Binary Pump, Split Sampler, Column Compartment s aktivním předehřevem
• Diodový array detektor, integrovaný fraction collector
• Řídicí software Chromeleon 7.3.1

Pro frakcionaci byly optimalizovány hodnoty prahů absorbance, rychlosti detekce a parametry jehly (výška, offset) tak, aby se přesně oddělily i jemné ramena nebo izomery značení.

Hlavní výsledky a diskuse

Testované oligonukleotidy označené CY5-BHQ2, AT647-BHQ2 a FAM-BHQ1 měly výchozí čistoty kolem 89–93 %. Po cílené frakcionaci a opakované analýze každé frakce bylo dosaženo kompletní odstranění UV-aktivních impurit, čímž každá konečná frakce vykázala 100 % relativní čistotu. Integrované fluidní cesty minimalizovaly rozptyl pásu a přesné řízení časování a polohy jehly zabránilo kontaminaci mezi frakcemi.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší:

• Vysokou reprodukovatelnost a čistotu (>99 %) u semi-preparativních objemů
• Flexibilitu pro různé typy značených oligonukleotidů
• Automatizaci procesu včetně vnějšího mytí a vnitřního proplachu jehly
• Rychlou reanalýzu vyčištěných frakcí bez přenastavování metody

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření automatizace a integrace s high-throughput platformami. Potenciál vidíme v adaptaci monolitických kolon, mikrofluidních přístrojích pro menší objemy a využití umělé inteligence k dynamickému řízení gradientů a frakcionace. Metoda by mohla sloužit i pro pokročilou výrobu RNA aptamerů či modifikovaných nukleotidů.

Závěr

Představená aplikace demonstrovala, že Vanquish Analytical Purification LC se sekvenčně řízeným fraction collectorem dokáže spolehlivě a automatizovaně purifikovat syntetické oligonukleotidy s vysokou čistotou. Celý workflow poskytuje robustní řešení pro farmaceutický vývoj, výzkum i diagnostiku.

Reference

1. Roberts T., Langer R., Wood M. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19:673–694.
2. Zhang Q., Lv H., W. Recent Methods for Purification and Structure Determination of Oligonucleotides. Int J Mol Sci. 2016;17(12):2134.
3. Catani M. et al. Oligonucleotides: Trends in Synthesis, Characterization and Purification. Biotechnol J. 2020;15(8):1900226.
4. Kanwal F. et al. Large-Scale in Vitro Transcription, RNA Purification and Chemical Probing Analysis. Cell Physiol Biochem. 2018;1915–1927.
5. Cramer H., Finn K., Herzberg E. Purity analysis and impurities determination by RP-HPLC. CRC Press. 2011.
6. Thermo Fisher Scientific Technical Note 72940: Principles of fraction collection using the Vanquish HPLC and UHPLC systems.