Advancing Low flow LC/MS for single cell proteomics with variable flow and 50 cm microfabricated pillar array columns

Význam tématu

Analýza proteomiky na úrovni jednotlivých buněk představuje klíčový přístup k rozpoznání heterogenity buněčných populací v nádorech, imunitních buňkách či buněčných kulturách. Umožňuje detekci vzácných buněk (např. oběžných nádorových buněk) a práci s extrémně malým množstvím materiálu, jako jsou exozomy či bioptické vzorky.

Cíle a přehled studie

Cílem představené studie je dosáhnout vysoké citlivosti a robustnosti LC/MS workflow pro single cell proteomiku kombinací proměnného průtoku (variable flow) a dlouhých (50 cm) mikrostrukturovaných pillar array kolonek. Systém je optimalizován pro zkrácení doby analýzy při zachování vysoké hloubky proteomové pokrytí.

Použitá metodika

Workflow zahrnuje:

• Izolaci jednotlivých buněk pomocí CellenONE nebo Tecan Uno Single Cell Dispenser a laserové mikroskopické disekce.
• Jednokrokovou enzymatickou digesci buněčného proteomu v LoBind 384-jamkové destičce.
• Přesné nanoinjekce objemu 10–100 nL ve Vanquish Neo UHPLC s protokolem trap-and-elute.
• Gradientní eluci při proměnném průtoku: počáteční vysoký průtok (750 nL/min) pro rychlý posun analyzátů následovaný snížením na nízký průtok (100 nL/min) pro zvýšení ESI účinnosti.
• Chromatografickou separaci na 50 cm mikrofabricovaných pillar array kolonách (µPAC Neo Plus).

Použitá instrumentace

• Vanquish Neo UHPLC systém
• µPAC Neo Plus HPLC kolony (50 cm)
• FAIMS Pro Duo rozhraní
• Orbitrap Exploris 240 a Orbitrap Astral MS spektrometry
• CellenONE a Tecan Uno Single Cell Dispenser
• Laserová mikrodiskekce tkáně

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace proměnného průtoku vedla k 83% instrumen­tální produktivitě zahrnující příjem vzorku, loading a ekvilibraci. Při analýze jednotlivých buněk HeLa bylo dosaženo průměrně 2000 proteinových skupin na buňku na Orbitrap Exploris 240. Vyšší korelace mezi velikostí buňky a pokrytím proteomu zlepšuje reprodukovatelnost dat. Využití Orbitrap Astral zvýšilo hloubku identifikace i throughput přibližně dvojnásobně.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Minimální ztráty vzorku díky přesnému přenosu a trap-and-elute protokolu.
• Vysokou citlivost při ultra nízkých průtocích pro detekci nízkoabundantních proteinů.
• Robustní a rychlý workflow (až 30 buněk/den).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace chromatografických systémů, integrace umělé inteligence pro optimalizaci datové akvizice a rozvoj targetovaných single-cell metod. Kombinace proteomiky s dalšími omickými přístupy (transkriptomika, metabolomika) rozšíří biologický vhled.

Závěr

Představené workflow spojuje vysokou citlivost, produktivitu a reprodukovatelnost pro rutinní i výzkumné aplikace single-cell proteomiky. Díky proměnnému průtoku a pokročilým MS analyzátorům lze dosáhnout hlubokého proteomového pokrytí s efektivním využitím instrumentálního času.