Deeper proteome coverage and faster throughput for single-cell samples on the Orbitrap Astral mass spectrometer

Význam tématu

Single-cell proteomika umožňuje odhalit heterogenitu biologických systémů analýzou jednotlivých buněk místo průměrování celé populace. Vyžaduje však extrémně citlivé a rychlé analytické metody pro nízké množství vzorku. Nový Orbitrap Astral hmotnostní analyzátor v kombinaci s pokročilou chromatografií a rozhraním FAIMS přináší hlubší pokrytí proteomu a vyšší průchodnost analýzy, což otevírá nové možnosti ve výzkumu buněčné různorodosti a biomarkerů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotí výkon Orbitrap Astral hmotnostního spektrometru v režimu data-independent acquisition (DIA) pro analýzu single-cell vzorků. Testované režimy zahrnují library-free i library-based přístupy. Cílem je porovnat hloubku pokrytí proteomu, přesnost kvantifikace a průchodnost metodiky při minimum vzorku (50 pg až 5 ng HeLa digesátu a jednotlivé buňky).

Použitá metodika a instrumentace

Workflow začíná přípravou vzorku pomocí CellenONE platformy a mikro-pillar array µPAC Neo kolony pro ultra-nízký průtok. Chromatografické metody 80 a 50 vzorků za den (SPD) používají Vanquish Neo UHPLC s gradienty 8–10 minut a celkovým časem 18–25 minut. Spektrometrické měření probíhá se synchronizovaným záznamem Orbitrap full scan spekter a rychlých Astral MS/MS spekter s FAIMS Pro interface pro potlačení pozadí. Data se zpracovávají v programovém balíku Spectronaut 18 (directDIA™ a library-based DIA) a Proteome Discoverer 3.1.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Astral hmotnostní spektrometr
• FAIMS Pro Duo interface
• Vanquish Neo UHPLC systém
• μPAC Neo HPLC kolona (50 cm a 25 cm IonOpticks Aurora Ultimate TS)
• CellenONE Cellenion Sample Prep platforma
• Spectronaut 18 a Proteome Discoverer 3.1 software

Hlavní výsledky a diskuse

Pro HeLa digest od 50 pg do 5 ng byla v režimu directDIA dosažena kvantifikace 2 700–6 650 proteinových skupin. Medián CV byl <10 % (7 % při 250 pg) a lineární korelace kalibračních křivek >0,9 i pro nejslabší signály. S library-based přístupem vzrostl počet proteomů až o 27 %. Metoda 50 SPD umožnila identifikovat až ~7 700 proteinových skupin z 250 pg. V inter-laboratorním testu na třech přístrojích a provozovatelích byla zachována RSD 2 %. Single-cell analýza HeLa prokázala kvantifikaci v průměru >3 400 proteinových skupin a >15 000 peptidů na buňku (režim directDIA), s nárůstem na >5 300 proteinových skupin při použití rozšířené knihovny.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a rychlost analýzy bez kompromisu na datové kvalitě
• Možnost analýzy jednotlivých buněk a velmi omezených vzorků
• Robustnost a reprodukovatelnost mezi laboratořemi a operátory
• Flexibilita library-free i library-based přístupu podle požadavků studie

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace a automatizace přípravy vzorků, rozšíření FAIMS pro selektivnější odstranění rušivých signálů a integrace dat s dalšími omickými vrstvami (transkriptomika, metabolomika). V praxi lze metodu využít v biomedicínském výzkumu, vývoji léků a laboratorní diagnostice pro studium buněčné heterogenity v nádorech, imunitní odpovědi nebo diferenciaci kmenových buněk.

Závěr

Orbitrap Astral spektrometr v kombinaci s pokročilou separací a FAIMS poskytuje nový standard v single-cell proteomice. Metodika přináší hlubší proteomové pokrytí, rychlejší průchodnost a vysokou kvantitativní přesnost, což otevírá nové možnosti ve výzkumu buněčné heterogenity a systemové biologie.