Advancing low flow LC/MS for single cell proteomics with variable flow and 50 cm microfabricated pillar array columns

Význam tématu

Proteomika na úrovni jednotlivých buněk představuje klíčovou technologii pro pochopení buněčné heterogenity, detekci biomarkerů a vývoj personalizované medicíny. Nízké vstupní množství proteinů vyžaduje vysoce citlivé chromatografické a hmotnostně spektrometrické přístupy s optimální efektivitou separace a minimálními ztrátami.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat, jak úprava chromatografických podmínek a optimalizace průtoku zvyšují hloubku pokrytí proteomu při analýze jednotlivých buněk HeLa. Autoři porovnali výkon kolony µPAC Neo Plus o délce 50 cm při různých průtocích a gradientních režimech a ověřili dopad velikosti buňky na identifikaci proteinů.

Použitá instrumentace

• Vanquish Neo UHPLC systém (Thermo Fisher Scientific)
• 50 cm µPAC Neo Plus kolony s 10 µm ID voltage spacerem
• Orbitrap Exploris 240 hmotnostní spektrometr (Thermo Fisher Scientific)
• Externí ohřívač kolon (Sonation PRSO-V2_PF)
• cellenONE platforma pro izolaci jednotlivých buněk (Cellenion)
• 384-well LoBind desky (Eppendorf)

Metodika

Jednotlivé buňky HeLa byly izolovány na platformě cellenONE, vloženy do LoBind desek s lysis/digestion směsí a zpracovány v jednom kroku s trypsinem/Lys-C. Vzorky byly analyzovány v režimu trap-and-elute s proměnlivým průtokem (počáteční 600 nL/min, eluce 100 nebo 200 nL/min). Data byly získána ve formátu DIA na Orbitrap Exploris 240 a vyhodnocena pomocí Proteome Discoverer s CHIMERYS nebo Spectronaut 19.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace spojení a průtoku kolony vedla k výraznému zúžení šířky píků a zvýšení citlivosti:

• Při eluci 100 nL/min a 30 SPD gradientu identifikováno přes 2000 proteinových skupin z jediné buňky.
• Optimalizace průtoku na 100 nL/min přinesla až 40% nárůst pokrytí proteomu oproti 250 nL/min.
• Nárůst rozlišení MS2 prodloužením maximálního IT zvýšil počet detekovaných proteinů.
• Variabilita kvantifikace vzrostla u jednotlivých buněk v porovnání s ředěnými bulk vzorky, což odráží biologickou heterogenitu.
• Hloubka pokrytí proteomu roste se zvětšující se velikostí buňky, přičemž byla definována devět velikostních binů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje vysoce citlivou a průběžně automatizovanou analýzu jednotlivých buněk s vysokým výtěžkem identifikací proteinů. Optimalizace proměnlivého průtoku a trap-and-elute režimu přináší rovnováhu mezi hlubokým proteomickým pokrytím a vyšší produktivitou instrumentu. To je zásadní pro standardizované workflow v biologickém výzkumu, farmacii a klinické diagnostice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zkracování doby analýzy při zachování vysokého pokrytí proteomu může urychlit studium velkých souborů jednotlivých buněk.
• Integrace s microfluidickými systémy a vyššími paralelními throughputy pro rozsáhlé populační studie.
• Vyšší rozlišení MS a pokročilé algoritmy pro analýzu DIA dat posunou citlivost a kvantifikaci na novou úroveň.
• Možnost multiplexních chemických štítků pro kombinovanou analýzu více buněčných stavů v jedné běhu.

Závěr

Optimalizované nízkoproudkové chromatografické podmínky s 50 cm µPAC Neo Plus kolonou a proměnlivým průtokem zásadně zvyšují citlivost a hloubku proteomického pokrytí jednotlivých buněk. Přes 2000 proteinových skupin identifikovaných z jediné HeLa buňky demonstruje potenciál metody pro široké nasazení v bio­logii a medicíně.

Reference

1. Matzinger M., Müller E., Dürnberger G., Pichler P., Mechtler K. Robust and Easy-to-Use One-Pot Workflow for Label-Free Single-Cell Proteomics. Anal. Chem. 2023, 95(9):4435–4445.