Orbitrap Astral mass spectrometer allows comprehensive proteome coverage at the single-cell level

Význam tématu

Proteomika na úrovni jednotlivých buněk nabízí detailní pohled na heterogenitu a funkční stav buněk, který ztrácí kumulativní měřením milionů buněk. Tato metoda je klíčová pro výzkum vývoje buněk, nádorové heterogenity, mechanismů onemocnění a identifikaci terapeutických cílů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní, vysoce citlivý a vysoce propustný workflow pro jednocelkovou proteomiku využívající automatizovaný systém pro izolaci a předúpravu buněk a kombinaci UHPLC a Orbitrap Astral MS. Studie demonstruje schopnost identifikovat tisíce proteinu z pouhých pikogramových množství materiálu a z jednotlivých buněk.

Použitá metodika

Workflow zahrnuje:

• Izolaci jednotlivých buněk a nanoliterové dávkování reagencií pomocí systému CellenONE s chipem proteoCHIP EVO 96 nebo standardními 96/384-jamkovými destičkami.
• Automatizované lýzu a enzymatickou digestii při kontrolované teplotě a vlhkosti.
• Chromatografickou separaci na systému Vanquish Neo UHPLC a kolonu Aurora TS, optimalizovanou pro průtok 0,2 µL/min s celkovým gradientem 14 min.
• Detekci pomocí Orbitrap Astral hmotnostního spektrometru ve DIA režimu s prostorem FAIMS Pro Duo pro snížení šumu.
• Analýzu dat v režimu library-free nebo library-based v softwaru Spectronaut 18 a alternativně v Proteome Discoverer s vyhledávačem CHIMERYS.

Použitá instrumentace

• CellenONE systém s proteoCHIP EVO 96
• Vanquish Neo UHPLC (Thermo Scientific)
• IonOpticks Aurora TS analytická kolona
• Orbitrap Astral MS s FAIMS Pro Duo
• Spectronaut 18, Proteome Discoverer s CHIMERYS

Hlavní výsledky a diskuse

Test ředění HeLa digestu od 50 pg do 10 ng ukázal, že library-free přístup identifikoval přes 4 200 proteinových skupin při 50 pg a přes 5 500 při 250 pg. Library-based analýza zvýšila identifikaci na zhruba 6 100 a 7 200 skupin. Medián CV byl nižší než 10 %.
Analýza 77 jednotlivých HeLa buněk odhalila v průměru 5 977 proteinových skupin a 34 894 peptidů, reprodukovatelnost mezi buňkami dosahovala R=0,93–0,98 a dynamický rozsah více než pět řádů.
ProteoCHIP EVO 96 zajistil průměrně 4 589 skupin z jedné buňky, 6 154 z deseti buněk a 6 642 ze dvaceti buněk. Standardní 96-well destička ukázala 6 556 skupin z deseti buněk a nízké kontaminace (<180 skupin v blank vzorcích).
Podíl membránových proteinů činil zhruba 23 % v plazmatické a 42 % v ostatních membránách.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace snižuje riziko ztrát a variabilitu, zkracuje dobu přípravy a umožňuje analýzu až 80 vzorků za den. Vysoká citlivost a reprodukovatelnost otevírá nové možnosti v diagnostice, farmacii i základním buněčném výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace multiplexních přístupů, další optimalizace automatizace, nasazení umělé inteligence pro validaci dat a rozšíření do klinických aplikací, například analýza cirkulujících nádorových buněk či detekce biomarkerů z minimálních objemů vzorku.

Závěr

Navržený integrovaný workflow kombinuje efektivní izolaci buněk, precizní chromatografii a vysoce citlivou detekci Orbitrap Astral MS. Prezentovaná studie potvrzuje vynikající hloubku pokrytí, vysokou reprodukovatelnost a minimální kontaminaci, což významně přispívá k rozvoji jednocelkové proteomiky.

Reference

1. Budnik B., Levy E., Harmange G., Slavov N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology, 2018.
2. Leduc A., Huffman R.G., Cantlon J., Khan S., Slavov N. Exploring functional protein covariation across single cells using nPOP. Genome Biology, 2022.
3. Ctortecka C. et al. An automated nanowell-array workflow for quantitative multiplexed single-cell proteomics sample preparation at high sensitivity. Mol. Cell. Proteomics, 2023.
4. Zhu Y. et al. Proteomic Analysis of Single Mammalian Cells Enabled by Microfluidic Nanodroplet Sample Preparation and Ultrasensitive NanoLC-MS. Angew. Chem. Int. Ed., 2018.
5. Liang Y. et al. Fully Automated Sample Processing and Analysis Workflow for Low-Input Proteome Profiling. Anal. Chem., 2021.
6. Johnson K.R., Gao Y., Greguš M., Ivanov A.R. On-capillary Cell Lysis Enables Top-down Proteomic Analysis of Single Mammalian Cells by CE-MS/MS. Anal. Chem., 2022.
7. Matzinger M., Müller E., Dürnberger G., Pichler P., Mechtler K. Robust and Easy-to-Use One-Pot Workflow for Label-Free Single-Cell Proteomics. Anal. Chem., 2023.
8. Ye Z. et al. One-Tip enables comprehensive proteome coverage in minimal cells and single zygotes. Preprint, 2023.
9. Matzinger M., Mayer R.L., Mechtler K. Label-free single cell proteomics utilizing ultrafast LC and MS instrumentation: A valuable complementary technique to multiplexing. Proteomics, 2023.
10. Guzman U.H. et al. Narrow-window DIA: Ultra-fast quantitative analysis of comprehensive proteomes with high sequencing depth. Preprint, 2023.
11. Ye Z. et al. High-throughput and scalable single cell proteomics identifies over 5000 proteins per cell. Preprint, 2023.
12. Zheng R. et al. A High-Sensitivity Low-Nanoflow LC-MS Configuration for High-Throughput Sample-Limited Proteomics. Anal. Chem., 2023.
13. Stewart H.I. et al. Parallelized Acquisition of Orbitrap and Astral Analyzers Enables High-Throughput Quantitative Analysis. Anal. Chem., 2023.
14. Arrey T. et al. Deeper proteome coverage and faster throughput for low input samples on the Thermo Scientific Orbitrap Astral mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific Technical Note, 2023.
15. Bubis J.A. et al. Challenging the Astral mass analyzer — going beyond 5200 proteins per single-cell at unseen quantitative accuracy to study cellular heterogeneity. Preprint, 2024.
16. Cheung T.K. et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nature Methods, 2021.
17. Ye Z. et al. A deeper look at carrier proteome effects for single-cell proteomics. Communications Biology, 2022.