Optimized one-pot single-cell proteomics workflow

Význam tématu

Single-cell proteomika je klíčová pro identifikaci a charakterizaci rozdílů mezi jednotlivými buňkami, které zůstávají skryté v klasických analýzách hromadných vzorků. Proteomická data poskytují přímou informaci o hladinách proteinů a jejich post-translačních modifikacích a doplňují údaje získané z analýz nukleových kyselin. Porozumění proteomickému profilu jednotlivých buněk je zásadní pro zkoumání mechanismů onemocnění, vývoj biomarkerů a pokročilé biomedicínské aplikace.

Cíle a přehled studie

Cílem příspěvku je představit optimalizovaný „one-pot“ workflow pro single-cell proteomiku, který spojuje automatizovanou přípravu vzorků, pokročilou chromatografii, iontovou mobilitu a novou metodiku široko-okenní akvizice (WWA) ve spojení s umělou inteligencí pro analýzu spekter. Studie demonstruje zlepšení pokrytí proteomu, zvýšení průchodnosti analýz a reprodukovatelnosti výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje následující klíčové komponenty:

• cellenONE s proteoCHIP pro obrazovou izolaci jednotlivých buněk v submikrolitrových objemech
• automatizovanou přípravu vzorků v 384-well destičkách s postupným přidáváním trypsinu, hydratací a 5 % DMSO pro maximalizaci výtěžku
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC systém s µPAC Neo HPLC kolónami pro špičkové dělení při ultranízkých průtocích
• FAIMS Pro rozhraní pro odstranění nežádoucích iontů a zvýšení citlivosti
• Orbitrap Exploris 480 masový spektrometr pro vysoce přesné a citlivé měření
• Proteome Discoverer software s CHIMERYS inteligentním vyhledávacím algoritmem a moduly pro kvantifikaci a lokalizaci modifikací

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace přípravy vzorků vedla k nárůstu počtu identifikovaných proteinů z ~1 000 na více než 1 300 při ekvivalentu jedné buňky. Experimenti na zředěném HeLa digestu stanovily optimální šířku WWA izolačního okna na 8–12 m/z, což maximalizuje počet PSM i bílkovinných identifikací. CHIMERYS dokáže zpracovat chimérická spektra a až zdvojnásobit počet identifikovaných peptidů oproti tradičním vyhledávačům. Dynamický rozsah dosahuje 4–5 řádů a workflow nevyžaduje nosičový kanál ani matching between runs, přičemž zachovává vysokou datovou úplnost.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný přístup nabízí:

• vysokou citlivost a reprodukovatelnost při analýze jednotlivých buněk
• automatizované a bezkontaktní zpracování vzorků v sub-µL objemech
• široké využití v základním i aplikovaném výzkumu (onkologie, neurobiologie, vývojové biologie)
• možnost kvantifikovat PTM, heterogenitu buněčných populací a sledovat dynamiku signálních cest

Budoucí trendy a možnosti využití

Single-cell proteomika směřuje k další integraci s multi-omickými přístupy a zvýšení průchodnosti analýz pomocí multiplexních značkovacích strategií. Očekává se aplikace na studium nádorové mikroprostředí, detailní mapování mozkových buněk a tvorbu celkových atlasů tkání. Rozvoj rychlejších softwarových nástrojů a lepších standardů kvality otevře cestu k klinickým a diagnostickým nasazením.

Závěr

Představené workflow spojuje nejmodernější techniky izolace, přípravy, chromatografie, iontové mobility a datové akvizice s inteligentní analýzou spekter. Výsledkem je citlivá, škálovatelná a vysoce reprodukovatelná metoda pro komplexní profilování proteomu jednotlivých buněk, která posouvá hranice výzkumu buněčné heterogenity.

Reference

1. Liu Y.; Beyer A.; Aebersold R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell 2016, 165, 535–550.
2. Macromolecular Components of E. coli and HeLa Cells. Thermo Fisher Scientific.
3. Volpe P.; Eremenko-Volpe T. Quantitative Studies on Cell Proteins in Suspension Cultures. Eur. J. Biochem. 1970, 12, 195–200.
4. Kulak N. A. et al. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nat. Methods 2014, 11, 319–324.
5. Mayer R. L. et al. Wide Window Acquisition and AI-based data analysis to reach deep proteome coverage for a wide sample range, including single cell proteomic inputs. 2022.
6. Truong T. et al. Data-Dependent Acquisition with Precursor Coisolation Improves Proteome Coverage and Measurement Throughput for Label-Free Single-Cell Proteomics. 2022.
7. Matzinger M. et al. Robust and easy-to-use one pot workflow for label-free single-cell proteomics. Anal. Chem. 2023.
8. Dorfer V. et al. MS Amanda, a Universal Identification Algorithm Optimized for High Accuracy Tandem Mass Spectra. J. Proteome Res. 2014, 13, 3679–3684.
9. Eng J. K. et al. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994, 5, 976–989.
10. Doblmann J. et al. apQuant: Accurate Label-Free Quantification by Quality Filtering. J. Proteome Res. 2019, 18, 535–541.
11. Taus T. et al. Universal and Confident Phosphorylation Site Localization Using phosphoRS. J. Proteome Res. 2011, 10, 5354–5362.
12. Pham T. et al. Single-cell proteomic analysis. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2021, 13, e1503.