Using Novel RNases to Measure 5’ Cap and Poly(A) Tail Modifications during Oligonucleotide Mapping LC-MS of mRNA

Význam tématu

Vývoj mRNA terapií vyžaduje detailní analytické metody, které potvrzují identitu, čistotu a strukturní modifikace (5′-cap, poly(A) tail) cílových molekul. Oligonukleotidové mapování spojené s LC-MS poskytuje cenné informace o sekvenční integritě a posttranskripčních úpravách, klíčové pro kvalitu a bezpečnost léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje nové enzymy RapiZyme MC1 a Cusativin pro komplementární štěpení RNA. Cílem bylo zlepšit pokrytí celé délky mRNA, zajistit vysokou důvěru v sekvenční identifikaci a umožnit současnou analýzu 5′-cap struktury a poly(A) ocasu z jednoho vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: HPRT1 sgRNA a modelová mRNA biologických replik.
Enzymatická digesce:

• MC1: štěpí vazby [A/U/C]-p-U, Cusativin: C-p-[U/A/G]
• Podmínky: 30 °C/30 min, poté inaktivace při 75 °C/15 min

LC-MS:

• Platformy: Xevo G3 MS a BioAccord MS s ACQUITY Premier LC a Premier OST
• Kolony: BEH C18 (130 Å nebo 300 Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm) při 60 °C
• Mobilní fáze: 10 mM DPA, 40 mM HFIP s DIPEA ve vodě/methanolu/acetonitrilu
• Detekce: UV při 260 nm, negativní ESI-MS (400–5 000 Da, 40 V, 2 Hz)
• Software: waters_connect pro data acquisition a analýzu

Hlavní výsledky a diskuse

RapiZyme MC1 a Cusativin generují částečně překrývající se oligonukleotidy s unikátními hmotnostmi, což umožňuje:

• Reprodukovatelné štěpení mezi dávkami (<95 % sekvenční pokrytí)
• End-to-end pokrytí včetně 5′-cap a 3′-poly(A)
• Detekci a kvantifikaci plně, částečně a nekapovaných 5′-koncových struktur bez další úpravy
• Analýzu délky poly(A) ocasu z jedné digesce

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou a jednoduchou přípravu vzorku bez přídavných inhibitorů, vysokou sekvenační jistotu i detekci endových úprav. Je vhodná pro QA/QC v biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření katalytických sad o další RNázy pro jemnější profilování, integrace pokročilých bioinformatických nástrojů pro automatizaci analýzy a aplikace na epitranskripční modifikace (metylace, pseudouridin).

Závěr

Nové RapiZyme enzymy MC1 a Cusativin poskytují komplementární štěpení pro komplexní oligonukleotidové mapování mRNA. Umožňují kompletní sekvenční pokrytí i analýzu endových modifikací v jednom pracovním postupu, což zlepšuje efektivitu a spolehlivost charakterizace mRNA terapeutik.

Reference

1. Thakur A. et al. Int J Mol Sci. 2022;23:7021.
2. Jumper J. et al. Nature. 2021;596:583.
3. Sehnal D. et al. Nucleic Acids Res. 2021;49:W431.
4. Addepalli B. et al. Waters Application Note 720008539. 2024.
5. Doneanu C. et al. Waters Application Note 720008677. 2025.
6. Menneteau T. et al. LCGC Int. 2025;2:26.