Tunable Digestions of RNA Using RapiZyme™ RNases to Confirm Sequence and Map Modifications

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá analýza sekvence a modifikací terapeutických RNA, zejména mRNA vakcín a CRISPR sgRNA, je klíčová pro vývoj a uvolňování moderních genových terapií a vakcín. Oligo mapování pomocí LC-MS umožňuje přesné potvrzení identity, čistoty a posttranslačních modifikací RNA bez nutnosti náročných chemických značení, což usnadňuje validaci a QA/QC procesy v laboratořích výzkumu i průmyslu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a otestovat protokal využívající rekombinantní enzymy RapiZyme MC1 a Cusativin pro spolehlivou, úplnou a znovuprodukovatelnou fragmentaci sgRNA. Studie porovnala tyto enzymy s klasickými RNázami (RNáza T1 a RNáza 4) z hlediska pokrytí sekvence, generace překrývajících se fragmentů a kvality LC-MS signálu.

Použitá metodika a instrumentace

• Enzymatická digesce: RapiZyme MC1 (pH 8) a Cusativin (pH 9) s možností částečné digesce pro generaci překrývajících fragmentů. RNáza T1 a RNáza 4 jako srovnávací nástroje.
• Chromatografie: ion-pair reverzní fáze na kolóně ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 (2.1×50 mm, 1.7 μm) při 70 °C.
• Mobilní fáze: kombinace DIPEA a IonHance HFIP ve vodě a v organické fázi (Acetonitril/Methanol).
• MS detekce: Xevo G3 QTof ve negativním režimu ESI, rozsah m/z 550–2000.
• Informatika: waters_connect aplikace (mRNA Cleaver, MAP Sequence, Coverage Viewer) a UNIFI pro automatické porovnání in silico predikovaných fragmentů s reálnými daty.

Hlavní výsledky a diskuse

• RapiZyme MC1 a Cusativin poskytly 100% pokrytí sgRNA sekvence díky generaci unikátních a překrývajících fragmentů, což vedlo k vysoké jistotě interpretace dat.
• RNáza T1 měla mezery v pokrytí (~78%) a vysokou ambiguální shodu malých fragmentů z G-bohatých oblastí.
• RNáza 4 sice dosáhla kompletního pokrytí, ale vyprodukovala diskrétní fragmenty bez překryvů a s nižší intenzitou signálu.
• RapiZyme enzymy vykazují reprodukovatelnost napříč různými šaržemi a umožňují jednoduchý „jednodílný“ protokol bez denaturantů či inhibitorů.
• Dominantní formou fosfátu u RapiZyme fragmentů byly cyklické produkty, které poskytují silnější signál než lineární fosfáty RNázy T1 či RNázy 4.

Přínosy a praktické využití metody

• Usnadněné a automatizovatelné workflow pro rutinní QC analýzy RNA terapeutik.
• Rychlá validace identity a modifikací RNA bez potřeby přídavných hybridizačních oligonukleotidů.
• Možnost vysokopropustného nasazení v objevové i QA/QC laboratoři s podporou regulací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj enzymatických nástrojů s odlišnou specificitou pro rozšíření analytických kapacit v RNA biologii. Integrace umělé inteligence a strojového učení do datové analýzy by mohla zrychlit interpretaci komplexních vzorků. Přechod na plně automatizovaná LC-MS stanoviště a cloudová řešení pro sdílení a komparaci dat posílí standardizaci a spolupráci v rámci odvětví.

Závěr

Protokol s RapiZyme MC1 a Cusativin pro LC-MS oligo mapování nabízí výrazné zlepšení pokrytí sekvence, reproducibility a kvality dat ve srovnání se standardními RNázami. Díky jednoduché přípravě, vysokému rozlišení fragmentů a plné integraci do waters_connect prostředí metoda ideálně podporuje požadavky na analytickou charakterizaci moderních RNA terapeutik.

Reference

1. Gau B. et al. Oligonucleotide Mapping Via Mass Spectrometry for mRNA Vaccine Characterization. Sci Rep. 2023.
2. Thakur P. et al. RNA Cleavage Properties of RNase MC1 and Cusativin. Int J Mol Sci. 2022.
3. Gaye MM. et al. Synthetic mRNA Oligo Mapping Using Ion Pairing LC-MS. Waters App Note. 2022.