RNA Digestion Product Mapping Using an Integrated UPLC-MS and Informatics Workflow

Význam tématu

Analýza produktů enzymatické digest sgRNA kombinující UPLC-MS a pokročilou informatikou poskytuje rychlou a přesnou kontrolu sekvence RNA pro vývoj genových léčiv. Díky vysoké citlivosti a specificitě LC-MS, spolu s automatizovanou datovou analýzou, lze potvrdit modifikace nukleotidů a dosáhnout vynikajícího pokrytí sekvence.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout integrovanou workflow pro mapování produktů enzymatické digest RNA založené na UPLC-MS a informatikách waters_connect. Testované enzymy zahrnovaly RNase T1, hRNase4 a nové RNázy T2 z Waters (RapiZyme MC1 a Cusativin). Studie demonstrovala efektivitu kombinace různých enzymatických štěpků a automatizovaného softwaru pro výrazné zkrácení doby analýzy a zvýšení spolehlivosti sekvenční verifikace.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 100-mer modifikovaný sgRNA s 2'-OMe a fosforotioátovými vazbami.
• Enzymatické digesty: RNase T1 (15 min při 37 °C), hRNase4 (60 min při 37 °C), RapiZyme MC1 a Cusativin (60 min při 37 °C).
• UPLC: ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 FIT 2.1×150 mm, 1.7 µm, 60 °C, 300 µL/min; mobilní fáze A: 10 mM DPA, 40 mM HFIP ve vodě pH 8.5; B: 50 % methanol s DPA a HFIP.
• MS: Xevo G3 QTof, ESI (−), MSE akvizice 340–4000 m/z, desolvační teplota 550 °C, kapilární napětí 2.5 kV, přesnost <1 ppm.
• Informatika: waters_connect MAP Sequence App, mRNA Cleaver MicroApp, Coverage Viewer MicroApp, CONFIRM Sequence App, UNIFI SIS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Digest RNase T1 a hRNase4 dosáhl 80–90 % unikátního pokrytí sekvence sgRNA.
• Nové enzymy RapiZyme MC1 a Cusativin poskytly 100 % pokrytí díky unikátním místům štěpení a překrývajícím se fragmentům.
• Automatizovaný software MAP Sequence zpracoval data za méně než 3 minuty, přiřazení více než dvaceti oligo produktů.
• Kombinace panelu enzymů významně zvýšila důvěru ve výsledky a minimalizovala nejednoznačné sekvence.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přesná validace sekvence modifikovaných RNA molekul.
• Podpora vývoje RNA léčiv a kontrola kvality ve výrobě.
• Automatizovaná workflow vhodná pro výzkum i výrobní QA/QC aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření enzymatického panelu a optimalizace chromatografie mohou zlepšit rozlišení isomerů a krátkých fragmentů. Integrace umělé inteligence a strojového učení do datové analýzy přinese rychlejší a robustnější sekvenční potvrzení rozsáhlých RNA molekul, včetně mRNA terapeutik.

Závěr

Integrované řešení UPLC-MS a waters_connect informatiky s použitím více enzymatických digest nabízí vysoce efektivní nástroj pro mapování RNA fragmentů. Nové enzymy RapiZyme MC1 a Cusativin dosahují 100 % pokrytí a spolu s automatizovaným softwarem zkracují dobu analýzy, což podporuje vývoj a kontrolu RNA léčiv.

Reference

• Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 2012;337:816–821.
• Jiang F, Doudna JA. CRISPR Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 2017;46:505–529.
• Ganbaatar U, Liu C. CRISPR Based COVID 19 Testing: Toward Next Generation Point of Care Diagnostics. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2021;11.
• Doneanu CE, Boyce P, Shion H, Fredette J, Berger SJ, Gastall H, Yu YQ. LC MS Analysis of siRNA Single Guide RNA and Impurities using the BioAccord System. Waters Application Note. 2022;720007546.
• Goyon A, Scott B, Kurita K, Crittenden CM, Shaw D, Lin A, Yehl P, Zhang K. Full Sequencing of CRISPR Cas9 Single Guide RNA via Parallel Ribonuclease Digestions and Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography High Resolution Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 2022;93:14792–14801.
• DEsposito RJ, Doneanu CE, Gastall H, Berger SJ, Yu YQ. RNA CQA Analysis using the BioAccord LC MS System and INTACT Mass waters_connect. Waters Application Note. 2023;720008130.
• Wolf EJ, Grunberg S, Dai N, Chen TH, Roy B, Yigit E, Correa IR. Human RNase 4 Improves mRNA Sequence Characterization by LC MS MS. Nucleic Acids Research. 2022;50:e106.
• Doneanu CE, Knowles C, Gorton M, Shion H, Fredette J, Yu YQ. CONFIRM Sequence A waters_connect Application for Sequencing of Synthetic Oligonucleotide and Their Impurities. Waters Application Note. 2022;720007677.
• Grunberg S, Wolf EJ, Jin J, Ganatra MD, Becker K, Ruse C, Taron CH, Correa IR, Yigit E. Enhanced Expression and Purification of Nucleotide Specific Ribonucleases MC1 and Cusativin. Protein Expression and Purification. 2022;190:105987.
• Thakur P, Atway J, Limbach PA, Addepalli B. RNA Cleavage Properties of Nucleobase Specific RNase MC1 and Cusativin Are Determined by the Dinucleotide Binding Interactions in the Enzyme Active Site. International Journal of Molecular Sciences. 2022;23:7021.
• Addepalli B, Johnston T, Reidy C, Lauber MA. Tunable Digestions of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications. Waters Application Note. 2024;720008539.