Sequence Mapping of mRNA Digests Using the Xevo™ MRT Mass Spectrometer and waters_connect™ MAP Sequence 2.0 Application

Význam tématu

Mapování sekvence mRNA nabízí detailní pohled na primární strukturu terapeutických mRNA molekul a je zásadní pro potvrzení integrity, sledování modifikací a zajištění kvality biotechnologických produktů, zejména mRNA vakcín a terapeutik.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout a demonstrovat plně automatizovaný workflow pro mapování sekvence mRNA (Firefly luciferáza) pomocí enzymatické digesce a UPLC-QToF MS (Xevo™ MRT).
• Ověřit přínos nových RNáz T2 (RapiZyme MC1, Cusativin) pro zvýšení sekvenčního pokrytí díky jedinečné specifitě štěpení a produkci překrývajících se oligonukleotidů.
• Implementovat informatikou řízenou analýzu dat s waters_connect™ MAP Sequence App v2.0 pro rychlou a spolehlivou identifikaci digesčních produktů a vizualizaci sekvenčního pokrytí.

Použitá metodika a instrumentace

• Enzymatická digesce: RNáza T1, RapiZyme MC1 a RapiZyme Cusativin s optimalizací podmínek (teplota, pH, doba inkubace) pro generování digesčních oligonukleotidů s kontrolovaným počtem chybějících štěpení.
• Chromatografie: ACQUITY Premier UPLC systém s C18 BEH Oligonucleotide kolonkou (2.1 × 150 mm, 1.7 µm, 300 Å), gradient HFIP/DIPEA–ACN, 400 µL/min, 70 °C, injekce 5 µL.
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo MRT Q-Tof s ESI(-), MSE (DIA) akvizice, rozsah 50–4000 m/z, vysoké rozlišení, akurátní hmotnost <1 ppm.
• Informatika: waters_connect™ platforma (v4.1.0.17), SYNTHETIC Library App v2.0 pro in-silico digesci, MAP Sequence App v2.0 pro zpracování MS1/MSE dat, přiřazení fragmentů a vizualizaci pokrytí.

Hlavní výsledky a diskuse

• RNáza T1 pokryla ~33 % sekvence mRNA s mnoha nejednoznačnými přiřazeními vyplývajícími z vysoké frekvence štěpení.
• RapiZyme MC1 a Cusativin dosáhly ~82 % a ~73 % pokrytí díky specifitě štěpení v dinukleotidových motivech a produkci delších oligonukleotidů s unikátní hmotností.
• Kombinací tří štěpení a využitím MSE fragmentace vzrostlo celkové pokrytí až na 95 %.
• Segmenty strukturálních izomerů byly rozlišené automaticky podle fragmentačního vzoru v MSE datovém proudu, čímž se zvýšila jistota přiřazení.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflow zkracuje dobu analýzy a minimalizuje manuální zásahy díky plné integraci chromatografie, hmotnostní spektrometrie a softwaru.
• Zajišťuje vysoce citlivé a specifické potvrzení sekvence a modifikací mRNA molekul, což je klíčové pro kontrolu kvality v průmyslové výrobě a výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj enzymatických štěpení s cílenou specifitou a regulací chybějících štěpení.
• Integrace LC-MS dat s NGS a nanopórovými metodami pro komplexní charakterizaci modifikovaných mRNA.
• Využití strojového učení pro předikci štěpení a optimalizaci parametrů analýzy.

Závěr

Demonstrace plně automatizovaného, vysoce pokročilého LC-MS workflow s využitím Xevo MRT a waters_connect™ MAP Sequence App v2.0 potvrdila schopnost rychlého, citlivého a spolehlivého mapování sekvence mRNA s pokrytím až 95 %, což významně přispívá k akceleraci vývoje a kontrole kvality mRNA bioterapeutik.

Reference

1. Xu S, Yang K, Li R, Zhang L. Vaccine era – Mechanisms, Drug Platform and Clinical Prospection. International Journal of Molecular Sciences. 2020;21(18):6582.
2. Verbeke R, Lentacker I, De Smedt SC, Dewitte H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 2021;333:511–520.
3. Jackson NA, Kester KE, Casimiro D, Gurunathan S, DeRosa F. The Promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines. 2020;5:15.
4. Synthetic mRNA Oligo-Mapping Using Ion-Pairing Liquid chromatography and Mass Spectrometry. Waters Application Note 720007669. 2022.
5. RNA CQA Analysis using the BioAccord LC-MS System and INTACT Mass waters_connect. Waters Application Note 720008130. 2023.
6. Sequence Mapping of sgRNA Digests: Leveraging Xevo MRT Mass Spectrometer Performance and Streamlining Data Analysis with MAP Sequence 2.0. Waters Application Note 720009130. 2025.
7. Jiang T, Yu N, Kim J, Murgo JR, Kissai M, Ravichandran K, Miracco E, Presnyak V, Hua S. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Analytical Chemistry. 2019;91:8500–8506.
8. Vanhinsbergh CJ, Criscuolo A, Sutton JN, Keely M, Williamson AJK, Cook K, Dickman M. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 2022;94:7339–7349.
9. Gau B, Dawdy AW, Wang HL, Bare B, Castaneda CH, Friese OV, Thompson MS, Lerch TF, Cirelli DJ, Rouse JC. Oligonucleotide Mapping via Mass Spectrometry to Enable Comprehensive Primary Structure Characterization of an mRNA Vaccine Against SARS CoV-2. Scientific Reports. 2023;13:9038.
10. Tang S, Liu GY, Yan Y, Wang S, Li N. Development of a Flow Through-Based Limited Digestion Approach for High-Throughput and High-Sequence Coverage Mapping of Therapeutic mRNAs. Analytical Chemistry. 2024;96:16944–17003.
11. Tunable Digestion of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications. Waters Application Note 720008539. 2024.