Quantification of underivatized acylcarnitinesand carnitine intermediates using RP chromatography and ion funnel triple quadrupole in fecal samples.

Význam tématu

Acylcarnitiny představují klíčové meziprodukty mitochondriálního metabolismu mastných kyselin a aminokyselin. Jejich analýza ve fekálních vzorcích umožňuje sledovat energetickou homeostázu a metabolické změny v gastrointestinálním traktu. Kvantifikace těchto látek pomáhá identifikovat biomarkery pro diagnostiku a sledování onemocnění, jako je zánětlivé onemocnění střev.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout robustní a vysoce výkonnou LC-MS/MS metodu schopnou rozlišit a kvantifikovat 32 acylcarnitinů s řetězci C0–C20 ve komerčních lidských fekálních vzorcích. Studie řeší problémy isobarických a izomerických interferencí a nabízí zkrácený čas analýzy bez nutnosti derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Byla použita reverzně-fázová chromatografie spojená s triple kvadrupólem a ion funnel technologií.

• Kapalinová chromatografie: Agilent Infinity II 1290 Bio LC, kolona Zorbax Eclipse Plus C18 (2.1×100 mm, 1.8 µm), teplota kolony 15 °C, autosampler 4 °C.
• Mobilní fáze: A – 15 mM acetát amonný s 0.3 % formiové kyseliny, B – MeOH:H2O 95:5 s 15 mM acetátu amonného a 0.3 % formiové kyseliny; gradient 2–100 % B v průběhu 15 min, celkově 21 min běhu.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6495D triple kvadrupól s ion funnel, režim Fragile, teplota plášťového plynu 300 °C, průtok plášťového plynu 11 L/min, plynu q-neb 250 °C, průtok 18 L/min, mlžítko 35 psi, kapilára 3000 V.
• Příprava vzorků: extrakce 120 mg fekálií v methanol:voda (8:2) s interními standardy, homogenizace, mražení, centrifugace, sušení a rekonstituce ve vodě:methanol (8:2).

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila chromatografické rozlišení všech 32 acylcarnitinů, včetně hlavních izomerů C4, C5 a C6. Kalibrační křivky vykázaly v rozsahu 0.1–500 nmol/L lineární závislost s R2 > 0.99. Repetibilita (RSD) byla pod 10 % a % návratnosti v rozmezí 80.4–121.9 %. V pilotním vyšetření vzorků od pacientů s Crohnovou chorobou a ulcerózní kolitidou byla pozorována tendence ke sníženým hladinám L-karnitinu a acylcarnitinů, ačkoliv statistická významnost nebyla potvrzena kvůli omezenému počtu vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní pokrytí: 32 acylcarnitinů v jednom běhu.
• Šetří čas: celková doba analýzy 21 min.
• Jednoduchá příprava: jedna extrakční fáze bez derivatizace.
• Vysoká přesnost: nízké RSD, vysoká návratnost.
• Aplikace: metabolomika fekálních vzorků, biomarkerová studie, QA/QC v klinických i výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu o další polaritní metabolity a lipidy pro komplexní metabolomické profily.
• Implementace do klinické diagnostiky a monitoringu gastrointestinálních onemocnění.
• Integrace s dalšími omickými technologiemi (proteomika, genomika).
• Automatizace přípravy vzorků a analýzy pro vysokopropustné platformy.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda nabízí spolehlivou, robustní a rychlou kvantifikaci širokého spektra acylcarnitinů ve fekálních vzorcích. Díky jednoduché extrakci bez derivatizace a výborné analytické výkonnosti představuje cenný nástroj pro výzkum a klinické aplikace v oblasti gastrointestinální metabolomiky.

Reference

• Lemons J.M.S. et al., Cell Mol Gastroenterol Hepatol (2023). doi:10.1016/j.jcmgh.2023.09.005
• Luna C. et al., Journal of Chromatography A, 1663 (2022). doi:10.1016/j.chroma.2021.462749
• Giesbertz P. et al., Journal of Lipid Research (2015). doi:10.1194/jlr.D061721