Deciphering the Microbiome: A Targeted LC/MSMS Method for the Analysis of Bile Acids in Biological Samples

Význam tématu

Bile kyseliny jsou klíčové pro trávení tuků a vstřebávání vitamínů. Sekundární bile kyseliny, vytvářené střevní mikrobiotou, ovlivňují imunitu, karcinogenezi a progresi nádorů. Spolehlivé a vysoce selektivní analytické metody pro jejich detekci usnadňují pochopení biodynamiky těchto molekul ve zdraví a onemocněních.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a standardizovat cílenou LC/MS/MS metodu pro současnou analýzu 68 unikátních bile kyselin v plasmě, séru a fekáliích hlodavců. Použitý analytický systém spojuje bioinertní UHPLC Agilent 1290 Infinity II BioLC s triple kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem Agilent 6495D s iFunnel technologií a umožňuje kvalitativní i kvantitativní měření v jednom běhu.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Agilent Poroshell 120 EC-C18 kolona (2,1×100 mm, 1,9 μm), teplota 50 °C, objem injekce 2 μl pro plasma/serum a 1 μl pro fekálie. Gradientní eluce s mobilem A (voda+0,1 % kyselina mravenčí) a B (acetonitril+0,1 % kyselina mravenčí) trvá 23 minut.
• Hmotová spektrometrie: Agilent Jet Stream Dual ESI, teplota zdroje 250 °C, dMRM režim v pozitivním a negativním módu, optimalizované parametry ionizace a MRM získané pomocí Metody Optimizer v MassHunter 12.1.
• Příprava vzorků: Proteinová precipitace 4násobným objemem acetonitrilu s 1 % kyselina mravenčí, centrifugace, vysušení pod sníženým tlakem. Fekálie extrahovány 80 % metanolem, bead-beating, mrazení a centrifugace. Volitelně použití Captiva EMR-lipid sad pro simultánní odstranění lipidů a proteinů (obnova > 85 %).
• Software: MassHunter Quantitative Analysis 12 pro kvantifikaci, Mass Profiler Professional pro chemometrickou analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje reprodukovatelného rozlišení izomerů a stabilního signálu i po 250 injekcích. Principal component analysis a hierarchické shlukování odhalily odlišné profily bile kyselin mezi testovanými skupinami vzorků. Metoda detekovala primární i sekundární bile kyseliny s vysokou selektivitou a citlivostí.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorunová analýza 68 bile kyselin.
• Aplikovatelné na plasmu, sérum i fekálie hlodavců s možností rozšíření na lidské vzorky.
• Možnost automatizace na platformě Agilent Bravo pro vysokoprodukční workflow.
• Vhodné pro metabolomiku, lipidomiku i proteomiku ve společných omics studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na klinické studie u lidí, integrace s dalšími omics daty, využití v personalizované medicíně a studiu mikrobiom-lidských interakcí. Dalším krokem může být adaptace na rychlé screeningové platformy a rozšíření analýzy o konjugované formy bile kyselin.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda představuje robustní nástroj pro cílenou analýzu 68 bile kyselin ve třech biologických maticích v jednom chromatografickém běhu. Umožňuje hloubkovou charakterizaci dynamiky bile kyselin v rámci pokročilých studií metabolismu a mikrobiomu.

Reference

1. Pietro Morlacchi et al. ASMS 2023 Poster MP 123. A semi-automated workflow for the analysis of circulating bile acids in plasma samples.
2. Sartain M. et al. Enabling Automated, Low Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform. Agilent Application Note 5994 2156 EN 2020.