Quantitation of TCA Cycle Metabolites with LC/TQ and Standardized HILIC Chromatography

Význam tématu

Studium metabolitů cyklu kyseliny citronové (TCA) je zásadní pro pochopení buněčné energetiky, metabolické reprogramace v nádorových buňkách a regulace imunitních odpovědí. Kvantitativní, citlivé a reprodukovatelné měření koncentrací TCA intermediátů v biologických matricích je nezbytné pro mapování metabolických cest, biomarkerový výzkum a hodnocení účinků léčiv nebo toxických vlivů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem application note je prezentovat standardizovaný, end‑to‑end workflow pro absolutní kvantitaci TCA metabolitů v bovinní plazmě a buněčných extraktech (K562). Práce demonstruje použití automatizovaného vzorkovacího workflow (Agilent Bravo), HILIC chromatografie na iron‑free 1290 Infinity II bio LC a citlivé MRM kvantifikace na Agilent 6495D triple quadrupole LC/MS s iFunnel technologií. Součástí je implementace 13C značených interních standardů pro přesnou absolutní kvantifikaci a rozšíření HILIC databáze přechodů pro 13C metabolity.

Použitá metodika

• Vzorky: bovinní plazma (20 µL) a buněčné extrakty z K562 kultur (1 M buněk).
• Extrakcí a čištěním: automatizovaná extrakce pomocí Agilent Bravo Metabolomics Sample Prep Platform a Captiva EMR–Lipid SPE destiček; suché extrakty rekonstituovány v ACN:H2O:MeOH (7:2:1) s přídavkem 13C CIL extraktu jako interního standardu.
• Kalibrace: kalibrační rozsah 1–100 000 nM (u většiny analytů), sedm bodů, šestnásobné injekce; použití 13C‑zněných standardů pro korekci matrix efektů.
• Chromatografie: Agilent Poroshell 120 HILIC‑Z 2.1×150 mm, 2.7 µm; mobilní fáze A: 20 mM amoniového acetátu, pH 9.3 + InfinityLab deactivator; B: acetonitril; průtok 0.4 mL/min; teplota kolony 15 °C; vzorkovač 4 °C; gradient (vysoký podíl organiky na začátku, rozdělení analyzovaných polaritních sloučenin v průběhu 0–19 min) a 5 min post‑run.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6495D triple quadrupole, Agilent Jet Stream ESI, měření v obou polaritách; optimalizované MRM přechody pro 12C a 13C varianty TCA metabolitů; iFunnel režimy (Fragile vs Standard) testovány individuálně pro analyty.

Použitá instrumentace

• Agilent 6495D triple quadrupole LC/MS (G6495D)
• Agilent 1290 Infinity II bio high‑speed pump (G7132A)
• Agilent 1290 Infinity II bio multisampler (G7137A)
• Agilent 1290 Infinity II multicolumn thermostat (G7116B)
• Agilent 1260 Infinity II diode array detector HS (G7117C)
• Agilent Bravo Metabolomics Sample Prep Platform a Captiva EMR–Lipid SPE destičky

Hlavní výsledky a diskuse

• Citlivost a linearita: většina TCA metabolitů vykázala v kalibračním rozsahu vynikající linearitu (R2 ~0.995–0.999) a nízkou relativní standardní odchylku (RSD často <10 %) při použití odpovídajících 13C interních standardů. Metoda pokrývá dynamický rozsah až šesti řádů velikosti koncentrací.
• iFunnel režim: testování Agilent iFunnel ve Fragile režimu vedlo ke zvýšení citlivosti pro většinu analyzovaných TCA metabolitů ve srovnání se Standard režimem; nastavení iFunnelu lze optimalizovat analyzátorově pro maximální signál.
• MRM a RT: pro každý analyte byly stanoveny optimalizované prekurzorové a produktové m/z hodnoty, kolísavé kolísání kolísání kolonek retence mezi ~2.7 min (pyruvát) až ~12.2 min (některé kyseliny a CoA deriváty), což umožňuje chromatografické rozlišení izomerů (citráty vs izocitráty, cis/trans aconitát).
• Detekce v matricích: všechny vybrané TCA metabolity byly detekovány v bovinní plazmě i v buněčných extraktech; kvantifikované koncentrace ležely uvnitř kalibračních rozsahů. Příklady naměřených koncentrací: pyruvát ~815 nM (plazma) vs 690 nM (K562); α‑ketoglutarát ~2 977 nM (plazma) vs 3 737 nM (K562); malát výrazně vyšší v buňkách (~9 556 nM) než v plazmě (~465 nM). Některé analyty (např. určitá trans/izomerická forma) byly v jedné matrici nízko nebo nedezápovány.
• Opakovatelnost: šestinásobné injekce vzorků a kalibrantů prokázaly robustní kvantitaci s nízkými RSD hodnotami, což potvrzuje vhodnost workflow pro cílené kvantitativní studie.

Přínosy a praktické využití metody

• Absolutní kvantifikace: použití 13C interních standardů umožňuje přesné a reprodukovatelné stanovení koncentrací metabolitů napříč matricemi.
• Robustnost pro kovově citlivé analyty: bio LC iron‑free konfigurace minimalizuje adsorpci a ztráty polarních kyselin, zlepšuje repdodukovatelnost retence a signálu.
• Využití: metoda je vhodná pro klinický a preklinický výzkum metabolických změn v onkologii, imunometabolice, toxikologii, i pro QA/QC laboratoře provádějící cílené metabolické analýzy nebo validaci biomarkerů.
• Škálovatelnost: workflow obsahuje automatizovanou sample‑prep platformu a rozsáhlou databázi MRM přechodů (více než 500 metabolitů), což umožňuje přechod mezi profilingem, semi‑kvantitativním screeningem a plně absolutní kvantifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření databází a standardizace přechodů: pokračující rozšiřování MRM knihoven (včetně 13C standardů) usnadní porovnatelnost mezi laboratořemi a study‑to‑study metaanalýzy.
• Vyšší throughput a miniaturizace: kombinace automatizace vzorkování, rychlejších gradientů a pokročilých kolonek bude podporovat vyšší objem analýz a menší spotřebu vzorků.
• Integrace s metabolickými flux studiemi: spojení absolutní kvantifikace s izotopovou tracing analýzou umožní kvantitativní mapování toku uhlíku cyklem TCA.
• Zdokonalení detekčních přístupů: další zvýšení citlivosti (pokročilejší iFunnel parametry, ion mobility, vyšší rozlišení) umožní detekci nízkoho abundance metabolitů a aplikaci na náročné matrice či single‑cell metody.
• Standardizace pro klinické aplikace: validované protokoly mohou být základem pro klinickou implementaci metabolomických biomarkerů v diagnostice nebo monitoringu terapie.

Závěr

Prezentované workflow kombinuje automatizovanou přípravu vzorků, HILIC‑Z chromatografii na iron‑free bio LC a citlivou MRM kvantifikaci na 6495D triple quadrupole, včetně optimalizovaných 13C přechodů pro TCA metabolity. Metoda prokázala vysokou linearitu, nízkou variabilitu a schopnost měřit analyty napříč širokým dynamickým rozsahem v plazmě i buněčných extraktech. Fragile režim iFunnelu zvýšil citlivost pro většinu testovaných metabolitů. Díky modularitě a rozsáhlé databázi je workflow vhodné pro cílené metabolomické studie, biomarkerovou validaci i pokročilé metabolické výzkumy.

Reference

1. Yamamoto T.; Sato K.; Yamaguchi M.; Mitamura K.; Taga A. Development of Simultaneous Quantitative Analysis of Tricarboxylic Acid Cycle Metabolites to Identify Specific Metabolites in Cancer Cells by Targeted Metabolomic Approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2021, 584, 53–59.
2. Yannell K. E.; Simmermaker C.; Van de Bittner G.; Cuthbertson D. An End‑to‑End Targeted Metabolomics Workflow. Agilent Technologies application note, publication number 5994‑5628EN, 2023.
3. Van de Bittner G. C.; Sartain M.; Chang D.; Apffel A.; Bernick K.; Gomez M. An Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples. Agilent Technologies application note, publication number 5994‑5065EN, 2022.
4. Sartain M.; Gomez M.; Van de Bittner G.; Shu H. Enabling Automated, Low‑Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform. Agilent Technologies application note, publication number 5994‑2156EN, 2020.
5. Yannell K. E.; Hsiao J.; Cuthbertson D. Mastering HILIC‑Z Separation for Polar Analytes. Agilent Technologies application note, publication number 5994‑5949EN, 2023.