An Analytically Validated Bioanalytical Clinical Research Method for the Quantification of Acylcarnitines in Urine

Význam tématu

Analýza acylkarnitinů v moči je klíčovým nástrojem klinického výzkumu poruch metabolizmu mastných kyselin. Přesné stanovení nízkých koncentrací těchto látek umožňuje diagnostiku metabolických onemocnění a monitorování léčby.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo vyvinout a analyticky validovat bioanalytickou metodu pro kvantifikaci vybraných acylkarnitinů v lidské moči bez nutnosti derivatizace. Metoda kombinuje gradientní reverzní fázovou chromatografii UPLC se tandemovou kvadrupólovou hmotnostní spektrometrií (UPLC–MS/MS).

Použitá instrumentace

• UPLC systém: ACQUITY Open Architecture UPLC
• Kolona: ACQUITY UPLC HSS T3, 1,8 µm, 2,1 × 150 mm
• MS detektor: Xevo TQ-S Tandem Quadrupole MS
• Řízení a vyhodnocení dat: MassLynx a TargetLynx Software

Použitá metodika

Vzorky moči (30 µl) byly odcentrovány, naředěny vodou, acetonitrilem a směsí stabilně značených interních standardů. Analýza probíhala při 45 °C kolony a 4 °C vzorkovače, objem injekce 2 µl, průtok 0,5 ml/min. Mobilní fáze A byla 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, fáze B 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu. Separace trvala 10 min. Detekce probíhala v pozitivním módu MRM s kolizní energií 14–26 eV a napětím 2,75 kV.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje lineárních křivek s r2 mezi 0,988 a 0,999 pro analyty propionyl-L-karnitin (C3), butyryl-L-karnitin (C4), valeryl-L-karnitin (C5), isovaleryl-L-karnitin (isoC5), hexanoyl-L-karnitin (C6), octanoyl-L-karnitin (C8), decanoyl-L-karnitin (C10) a dodecanoyl-L-karnitin (C12). Meze kvantifikace (LLOQ) byly stanovena mezi 1,5 a 7,5 ng/ml v roztoku (odpovídá 7,5–37,5 ng/ml v moči). Intradenní i mezidenní přesnost a přesnost měření splňují kritéria FDA (RSD < 15 % a bias v rozsahu ± 15 %). Nulový nebo nevýznamný carryover (< 20 %) potvrzuje robustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda vyžaduje minimální připravu vzorku bez derivatizace, malý objem moči (30 µl) a umožňuje rychlé vyšetření osmi acylkarnitinů v rámci jednoho běhu. Díky vysoké citlivosti a přesnosti je vhodná pro klinické studie a farmakokinetické analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody o další homologické řady acylkarnitinů a aplikace v metabolomice. Další trendy zahrnují integraci s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií a automatizovanou přípravou vzorků pro zlepšení throughput.

Závěr

Vyvinutá UPLC–MS/MS metoda pro kvantifikaci acylkarnitinů v moči je rychlá, selektivní a validovaná podle standardů FDA. Nabízí spolehlivé nástroje pro klinický výzkum a diagnostiku metabolických onemocnění.

Reference

• 1. Vernez L, Thormann W, Krähenbühl S. Analysis of carnitine and acylcarnitines in urine by capillary electrophoresis. J Chromatogr A. 2000;895(1–2):309–16.
• 2. FDA. Bioanalytical Method Validation. May 2001.
• 3. FDA Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. Draft Guidance, September 2013.