LC/MS/MS Method for Quantification of Acylcarnitines and Carnitine Intermediates

Význam tématu

Acylkarnitiny jsou klíčovými metabolity zapojenými do mitochondriální beta-oxidace mastných kyselin a metabolismu aminokyselin. Jejich množství a složení v biologických matricích odrážejí stav energetického metabolismu, mitochondriální funkce a indikují zánětlivé či mikrobiomově podmíněné změny. Spolehlivá, kvantitativní a standardizovaná analýza acylkarnitinů je proto důležitá pro základní biomedicínský výzkum, DMPK (drug metabolism and pharmacokinetics), translační biomarkery a bezpečnostní hodnocení léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem application note je popsat standardizovaný LC/MS/MS postup pro kvantifikaci 32 acylkarnitinů (C0–C20) v plazmě a fekáliích bez nutnosti derivatizace. Metoda má být kompatibilní se standardizovanými omics platformami, poskytovat široké lineární rozmezí, dobrou reprodukovatelnost a dostatečnou selektivitu pro rozlišení isomerů, přičemž je vhodná pro vysokopropustné pracovní postupy v preklinickém i translačním výzkumu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje jednoduchou extrakci, reverzní fázovou chromatografii a selektivní detekci na triplekvadrupolovém LC/MS v módu dMRM:

• Plazma: 20 µL vzorku + 20 µL izotopických interních standardů (20 ng/mL v methanolu) + 60 µL isopropanolu s 0,3 % kyselinou mravenčí. Vzorky byly vortexovány 5 min a sráženy centrifugací 10 000 × g, 10 min, 4 °C. Do chromatografie se injektovalo 2 µL po 1:4 naředění supernatantu.
• Fekálie: ~120 mg materiálu v keramických kuličkách, extrakce ledovým methanolem:vodou (8:2, v/v) s interními standardy na finální poměr 100 mg/mL, homogenizace, inkubace přes noc při −80 °C, centrifugace 20 000 × g, 20 min, 4 °C. 100 µL supernatantu bylo vysušeno a rekonstituováno nejprve 20 µL methanolu a poté 80 µL vody (důležité pro rozpustnost dlouhých řetězců).
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II Bio LC; kolona Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (2.1 × 100 mm, 1.8 µm); injekční objem 2 µL; teplota kolony 15 °C; autosampler 4 °C; gradientní eluce s celkovým časem běhu ~21 min.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6495D triple quadrupole s iFunnel, pozitivní ESI, dynamické MRM (dMRM). U většiny analyzátů byl kvantifikátorem fragment m/z 85.1; L‑karnitin (C0) použil m/z 43.1 a deoxykarnitin m/z 45.1. Pro absolutní kvantifikaci byly používány izotopicky značené interní standardy, u některých sloučenin byly použity nejbližší vhodné standardy z důvodu omezené dostupnosti značených látek.
• Softwarová podpora: MassHunter Acquisition (Compound Optimizer, Source Optimizer) pro optimalizaci a MassHunter Quantitative Analysis pro kvantifikaci a vizualizaci kalibračních křivek.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda umožnila oddělení a kvantifikaci 32 acylkarnitinů od C0 do C20 v jedné analýze bez derivatizace. Kritické izomerní dvojice (např. butyryl‑/isobutyryl‑ C4 a valeryl‑/isovaleryl‑/2‑methylbutyryl‑ C5) byly baseline‑rozlišené, což snižuje riziko nesprávné identifikace biomarkerů.
• Linearity: kalibrační křivky pro analyty vykazovaly R2 > 0,99 v rozsazích 0,01–500 ng/mL pro plazmu a 0,1–500 nmol/L pro fekálie, čímž byla pokryta široká dynamika nutná pro biologické aplikace.
• Senzitivita a selektivita: selektivní dMRM přístupu v kombinaci s vhodnou chromatografií umožnila vysoce citlivá a selektivní kvantifikaci bez ion‑pairing činidel, čímž se zlepšila robustnost a snížilo riziko kontaminace zařízení.
• Opakovatelnost a recovery: většina analytů vykázala relativní standardní odchylku (RSD) < 10 % napříč replikáty; recovery v modelech přidání před/po extrakci se pohybovala přibližně 80–122 %, což potvrdilo efektivitu jednoduchého extrakčního protokolu.
• Propustnost: celkový běh 21 minut na vzorek (včetně re‑equilibrační fáze) podporuje vysokopropustné nasazení v DMPK a translačních studiích.
• Aplikace na biologická data: pilotní analýza fekálií u malého počtu pacientů s IBD ukázala trend k poklesu L‑karnitinu a některých acylkarnitinů ve srovnání se zdravými kontrolami; vzhledem k omezenému počtu vzorků jsou výsledky exploratorní.

Přínosy a praktické využití metody

• Derivatizace není nutná, což zkracuje přípravu vzorků a snižuje variabilitu mezi sériemi.
• Standardizované podmínky (kolona, gradient, dMRM nastavení) umožňují harmonizaci dat mezi laboratořemi a snadnou integraci do omics platforem.
• Metoda je vhodná pro: monitorování mitochondriálních dysfunkcí, fenotypování lipidového metabolismu, DMPK studie, bezpečnostní hodnocení léčiv a translační biomarkerové projekty včetně mikrobiomu.
• Baseline oddělení isomerů umožňuje přesnější mechanistickou interpretaci výsledků a snižuje riziko falešně pozitivních biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu a zlepšení dostupnosti izotopicky značených standardů pro všechny analyty zvýší přesnost absolutní kvantifikace.
• Automatizace přípravy vzorků a nasazení interních QC standardů umožní širší vysokopropustné a multi‑center biologické studie.
• Integrace s dalšími omics (lipidomika, proteomika, metagenomika) pro holistickou interpretaci metabolických fenotypů a host‑mikrobiom interakcí.
• Standarizované mezilaboratorní validace a harmonizace metodologie podpoří přenositelnost výsledků do klinického výzkumu a případné validace jako regulované analytiky.
• Další technologické směry zahrnují rozvoj cílených nativních standardů, zlepšení instrumentálních i softwarových nástrojů pro automatické rozlišení isomerů a škálování do klinických koherentních studií.

Závěr

Popsaná LC/MS/MS metoda poskytuje robustní, derivatizace‑volnou a standardizovanou cestu pro kvantifikaci širokého spektra acylkarnitinů v plazmě a fekáliích. Metoda kombinuje dostatečnou selektivitu pro rozlišení isomerů, široké dynamické rozmezí, dobrou reprodukovatelnost a vysokou propustnost, což ji činí využitelnou pro výzkum mitochondriálních poruch, studií mikrobiomu, DMPK a translační biomarkerová výzkumná šetření. Mezi klíčová omezení patří dostupnost izotopických standardů a potřeba širších validačních studií pro klinickou aplikaci.

Reference

1. Luna C.; et al. A clinically validated method to separate and quantify underivatized acylcarnitines and carnitine metabolic intermediates using mixed‑mode chromatography with tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2022, 1663, 462749.
2. Giesbertz P.; et al. An LC‑MS/MS Method to Quantify Acylcarnitine Species Including Isomeric and Odd‑Numbered Forms in Plasma and Tissues. J. Lipid Res. 2015, 56 (10), 2029–2039.
3. Lemons J. M. S.; et al. Excess Dietary Sugar Alters Colonocyte Metabolism and Impairs the Gut Barrier. Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol. 2023.
4. Adams S. H. Emerging Perspectives on Essential Amino Acid Metabolism in Obesity and the Metabolic Syndrome. Annu. Rev. Nutr. 2011, 31, 507–528.
5. Schooneman M. G.; Vaz F. M.; Houten S. M.; Soeters M. R. Acylcarnitines: Reflecting or Inflicting Insulin Resistance? Diabetes 2013, 62 (1), 1–8.
6. Rinaldo P.; et al. Clinical and Biochemical Features of Fatty Acid Oxidation Disorders. Clin. Chem. 2008, 54 (4), 701–719.
7. Hoyles L.; et al. Molecular Phenomics and Metagenomics of Hepatic Steatosis in Non‑Diabetic Obese Women. Nat. Microbiol. 2018, 3, 537–550.
8. McCoin C. S.; Knotts T. A.; Adams S. H. Acylcarnitines—Old Actors Auditioning for New Roles in Metabolic Physiology. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2015, 308 (11), E978–E989.
9. Minkler P. E.; et al. Quantification of Malonyl‑Coenzyme A in Tissue Specimens by High‑Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. Anal. Biochem. 2008, 376 (1), 31–39.