Expediting Method Development for Oligonucleotide Impurity Analysis Using the ACQUITY™ QDa™ II Mass Detector

Význam tématu

Oligonukleotidy se uplatňují v moderní farmakoterapii (antisense oligo, siRNA, aptamery, mRNA) a jejich klinický význam roste. Při syntéze vznikají nečistoty ve formě zkrácených sekvencí (shortmers) nebo prodloužených verzí (longmers), které mohou ovlivnit účinnost a bezpečnost léčiva. Tradiční IP-RPLC s UV detekcí často nedokáže s dostatečnou specifičností odlišit blízce příbuzné varianty, proto je třeba metody obohatit o hmotnostní detekci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo zrychlit vývoj LC-UV metod pro profilování nečistot oligonukleotidů integrací kompaktního hmotnostního detektoru ACQUITY QDa II. Modelovaly se dvě plné délky 25merů (FLP-PO a FLP-PS) včetně jejich n-1 krátkých fragmentů. Využitím čtyřnásobného čerpadla ACQUITY Premier QSM s reálnou optimalizací iontově-párovacích podmínek a inline MS potvrzením identity nečistot se zkrátila doba vývoje metod.

Použitá instrumentace

• LC systém: ACQUITY Premier QSM
• Detektor UV: ACQUITY UPLC/TUV, λ=260 nm
• Hmotnostní detektor: ACQUITY QDa II, režim negativní ESI, rozsah 350–1500 m/z, SIR monitoring
• Kolona: Premier Oligonucleotide BEH C18, 4,6 × 150 mm, 2,5 µm, 70 °C
• Solventy: voda, MeOH/ACN 50/50, iontově-párovací roztoky DBA/HFIP nebo TEA/HFIP
• Software: Empower 3.8.1

Hlavní výsledky a diskuse

1) Optimalizace koncentrace DBA pro FLP-PO:

• Rozlišení FLP a n-1 shortmeru vzrostlo s koncentrací DBA až do 10 mM, ale nad 5 mM docházelo k potlačení MS signálu.
• Optimální poměr: 2,5 mM DBA/18–34 % organiky (gradient), zajišťující USP rezoluci > 1,5 a minimální MS supresi.

2) Robustnost a naložení vzorku:

• Lineární závislost plochy píků na hmotnostním naložení; rozlišení zůstalo konstantní při zvýšené dávce, vhodné pro QC.

3) Profilování inherentních nečistot FLP-PO:

• SIR i UV integrace vykázaly 4,1 % celkových n-1 nečistot.
• Full scan analýza umožnila přiřadit majoritní n-C shortmer a doprovodné n-T, n-A, n-G.

4) FLP-PS s TEA/HFIP:

• Optimální koncentrace TEA: 15 mM (8–11 % gradient) poskytla oddělení n-T shortmeru a PO nečistoty s vyváženým MS signálem.
• SIR diferencovalo oxidovaný PO pík (11,15 %) od n-C shortmeru (2,55 %), které se v UV jevily jako společná šíře.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby vývoje metod díky inline quaternární míchání solventů a reálné optimalizaci.
• Inline MS detektor zvyšuje jistotu identifikace nečistot a kvantifikace, kde UV detekce selhává.
• Metoda je reprodukovatelná při různých naloženích, vhodná pro rutinní QA/QC i regulované laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na větší a chemicky modifikované oligonukleotidy či glykanové analýzy.
• Automatizace a vysokopropustné systémy využívající umělou inteligenci pro prediktivní optimalizaci gradientů a iontově-párovacích podmínek.
• Integrace s online monitorováním výrobních procesů (PAT) pro okamžitou kontrolu kvality.

Závěr

Popisovaný LC-UV/MS přístup s ACQUITY Premier QSM a ACQUITY QDa II nabízí rychlý a robustní nástroj pro vývoj a rutinní kontrolu nečistot oligonukleotidů. Kombinace čtyřnásobného čerpadla pro reálnou optimalizaci a kompaktního MS detektoru umožňuje spolehlivou identifikaci i kvantifikaci blízce elucujících variant, zvyšuje reprodukovatelnost a podporuje splnění požadavků regulátorů.

Reference

1. N. M. El Zahar et al., Chromatographic approaches for the characterization and quality control of therapeutic oligonucleotide impurities. Biomedical Chromatography, 2018, 32, e4088.
2. F. Eckstein, Phosphorothioates, essential components of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics, 2014, 24(6), 374–387.
3. S. M. McCarthy, M. Gilar, Hexylammonium Acetate as an Ion-Pairing Agent for IP-RP LC Analysis of Oligonucleotides. Waters Application Note, 720003361, 2016.
4. R. E. Birdsall, X. Du, K. Nyholm, Extending the Analytics of Biopharmaceutical QA/QC Labs with the ACQUITY QDa II Mass Detector. Waters Application Note, 720008386, 2024.
5. P. Bigos et al., Advancing Sensitivity and Efficiency in Released N-Linked Glycan Analysis With the ACQUITY QDa II Mass Detector. Waters Application Note, 720008631, 2024.
6. Z. Kadlecová et al., Phosphorothioate oligonucleotides separation in ion-pairing reversed-phase liquid chromatography: effect of ion-pairing system. J. Chromatogr. A, 2022, 1676, 463201.
7. K. J. Fountain et al., Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem IP-RP HPLC/ESI-MS. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 17, 646–653.