Waters ACQUITY QDa Detector - QC APPLICATIONS COMPENDIUM - EDITION 2

Monitorování syntetických oligonukleotidů s využitím hmotnostní detekce pomocí ACQUITY QDa

Význam tématu
Účinná kontrola kvality syntetických oligonukleotidů je v moderním farmaceutickém vývoji klíčová – nutnost rychle a spolehlivě potvrdit identitu, čistotu a integritu krátkých sekvencí DNA či RNA. Tradiční HPLC-UV metody často postrádají selektivitu potřebnou pro některé aplikace, zejména při zjišťování modifikací, aduktů či stopových nečistot.

Cíle a přehled studie
Cílem bylo ukázat, že hmotnostní detekce pomocí nového ACQUITY QDa detektoru může být nenáročně integrována do stávajících LC-UV metod (iontově párované RP-RPLC) za účelem rozšířeného sledování oligonukleotidů. Studie se zaměřila na pět polyT standardů (15–35 nukleotidů) a posoudila přesnost, citlivost a opakovatelnost detekce.

Použitá metodika a instrumentace

• Separace: ACQUITY UPLC H-Class Bio System s injektorem FTN a kolona Peptide CSH C18 (1,7 µm, 2,1×50 mm), teploty 60 °C.
• Detekce UV: TUV detektor při 260 nm.
• Hmotnostní detekce: ACQUITY QDa v negativním režimu, m/z 410–1250 Da, ESI, vzorkovací frekvence 2 Hz.
• Mobilní fáze: 15 mM TEA/400 mM HFIP ve vodě a v MeCN, izokraticky nebo v gradientu.
• Software: MassLynx 4.1, dekonvoluce spekter algoritmem MaxEnt1.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografie: pěkné rozlišení pěti polyT standardů za méně než 4 min, vysoká linearita UV signálu (R²>0,999) v rozsahu 0,24–1000 pmol.
• Hmotnostní spektrum: každá oligo sekvence vykázala 5–9 nabitých stavů; QDa přesně měřil m/z hodnoty s odchylkou do ±0,2 Da a RSD <0,02 %.
• Dekonvoluce: zpracování MaxEnt1 přineslo přesné nulté náboje s rozdílem do 0,7 Da od teoretické hmotnosti, včetně detekce sodných aduktů.
• Citlivost: metoda je schopna detekovat i nižší oligonukleotidové koncentrace díky kombinaci UV a MS detekce; QDa rozpoznal ionty, které UV postrádá.

Přínosy a praktické využití metody

• Snadná implementace: QDa se instaluje do LC sekvence místo PDA detektoru bez náročné údržby či školení obsluhy.
• Zvýšená selektivita: identifikace sekvencí a derivátů pro potvrzení identity či sledování nečistot.
• Vysoká propustnost: rychlá separace a on-line dekonvoluce přispívají k efektivitě QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace MS detekce do rutinního monitorování terapeutických oligonukleotidů.
• Sledování modifikací (konjugáty, blokátory, adukty) v průběhu vývoje a stability.
• Kombinace s automatizovanými softwarovými postupy pro vysokou propustnost a validovatelnost.

Závěr
Metoda spojující iontově párovanou RP-RPLC s UV a hmotnostní detekcí na ACQUITY QDa nabízí robustní, citlivé a specifické řešení pro QC analýzu syntetických oligonukleotidů. QDa detektor lze snadno integrovat do stávajících optických metod a rozšířit je o cennou MS informaci, čímž se zlepší kvalita a spolehlivost rutinní kontroly kvality.