Digesta Ex Machina: Automating Sample Preparation for Oligo Mapping With Rapizyme™ MC1 and Cusativin on Andrew+™ Robot

Význam tématu

Řízená digesce RNA před analýzou LC-MS je zásadní pro detailní charakterizaci terapeutických a výzkumných RNA molekul. Automatizace tohoto kroku přináší vyšší přesnost, opakovatelnost a efektivitu, což je klíčové pro kontrolu kvality, vývoj metod a vysokoprodukční laboratoře.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo adaptovat manuální protokol digesce RNA enzymy RapiZyme MC1 a Cusativin pro platformu Andrew+ Pipetting Robot s minimálními úpravami. Autoři porovnali manuální a automatizovanou přípravu sgRNA cílené na gen GATA2, ověřili reprodukovatelnost postupu pro osm vzorků a potvrdili ekvivalenci výsledků.

Použitá metodika

Reakční směs obsahovala 10 µg sgRNA, 100 U enzymu a 200 mM pufr amonného acetátu (pH 8 0 pro MC1, pH 9 0 pro Cusativin). Incubace probíhala při 30 °C po dobu 15 minut, následovala heat inaktivace (70 °C pro MC1, 75 °C pro Cusativin) po dobu 15 minut. Po krátkém odstředění byly vzorky připraveny v 300 µL šroubovacích vialkách pro přímou LC-MS analýzu.

Použitá instrumentace

• Andrew+ Pipetting Robot s elektronickými pipetami Waters
• Peltier+ Connected Device pro inkubaci PCR proužků
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 kolona (2 1 x 50 mm, 1 7 µm)
• ACQUITY Premier UPLC systém s BSM modulem
• Xevo G3 QTof hmotnostní spektrometr s ESI detekcí v negativním osvětlení

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání chromatogramů manuální a automatizované digesce ukázalo vysoce konzistentní profily fragmentů s drobnými rozdíly v intenzitách vyvolanými rychlejším tepelným rampováním na Peltier+. Reprodukovatelnost osmi paralelních příprav na Andrew+ robotu byla excelentní, jak dokládají překryvy triplicitních analýz. Analýza pokrytí sekvence pomocí waters_connect MAP Sequence App prokázala 100% pokrytí cílové sgRNA pro oba enzymy.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduché nasazení v QA/QC, analýze a vývoji metod
• Automatická příprava až osmi vzorků pod 45 minut
• Vysoká opakovatelnost bez potřeby dodatečného čištění
• Lepší pokrytí sekvence díky částečné digesci s překrývajícími produkty

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizované digesční protokoly mohou být rozšířeny na další typy RNA včetně mRNA či CRISPR sgRNA různých délek. Integrace s laboratorními informačními systémy a pokročilá softwarová analýza fragmentů umožní zrychlenou validaci kvality a modifikací RNA terapeutik.

Závěr

Vývoj automatizovaného protokolu pro digesci RNA enzymy RapiZyme MC1 a Cusativin na Andrew+ robotu potvrdil vysokou ekvivalenci s manuálním postupem a vynikající reprodukovatelnost. Metoda zrychluje přípravu vzorků a zabezpečuje konzistentní výsledky pro LC-MS oligo mapování.

Reference

1. Addepalli B, Johnston T, Reidy C, Lauber M Tunable Digestions of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications Waters Application Note 720008539, September 2024
2. Doneanu C, Preston C, Gorton M, Johnson T, Addepalli B, Yu Y RNA Digestion Product Mapping Using an Integrated UPLC-MS and Informatics Workflow Waters Application Note 720008553, September 2024